轉鐵蛋白受體的單克隆抗體OX26偶聯三氧化二砷免疫脂質體對鼠腦膠質瘤細胞系的體外抑制作用

陳　巖　郭美華　海　鑫　張　旭

轉鐵蛋白受體的單克隆抗體OX26偶聯三氧化二砷免疫脂質體對鼠腦膠質瘤細胞系的體外抑制作用

陳巖郭美華海鑫張旭

【摘要】目的探討轉鐵蛋白受體單克隆抗體(OX26)偶聯三氧化二砷(As2O3)免疫脂質體對鼠腦膠質瘤細胞株的體外抑制作用。方法體外培養C6腦膠質瘤細胞，實驗分為鹽水組，As2O3(6 μmol·L-1)組和OX26偶聯As2O3脂質體(6 μmol·L-1)組；采用四唑鹽比色法(MTT)，檢測OX26偶聯As2O3免疫脂質體對腦膠質瘤細胞生長的抑制作用，DAPI染色觀察OX26偶聯As2O3免疫脂質體對腦膠質瘤細胞促凋亡的影響。免疫印跡法檢測OX26偶聯As2O3免疫脂質體對腦膠質瘤細胞膠質瘤膠質纖維酸性蛋白(GFAP)蛋白表達的影響。結果MTT比色法檢測顯示：OX26偶聯As2O3免疫脂質干預對腦膠質瘤生長的抑制率為40.21%，顯著高于As2O3組的25.77%，比較差異有統計學意義(P<0.05)；核染顯示：與鹽水組和As2O3組比較，OX26偶聯As2O3免疫脂質組腦膠質瘤細胞的光密度和面密度值顯著減少，比較差異有統計學意義(P<0.01)；Westernblot檢測顯示：OX26偶聯As2O3免疫脂質組腦膠質瘤細胞GFAP蛋白的表達較鹽水組和As2O3組少。結論OX26偶聯As2O3免疫脂質體對鼠腦膠質瘤細胞具有明顯的體外抑制作用，其作用機制可能與促進腦膠質瘤細胞凋亡和GFAP蛋白的表達相關。

【關鍵詞】三氧化二砷；轉鐵蛋白受體的單克隆抗體；腦膠質瘤；膠質瘤膠質纖維酸性蛋白

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:007～009)

我們前期研究通過制備As2O3脂質體，并且證實As2O3脂質體可更顯著地誘導鼠腦膠質瘤細胞凋亡，延長載瘤鼠的存活時間，其療效優于單純的As2O3治療[1]。本研究在前期基礎上，研究了轉鐵蛋白受體的單克隆抗體(OX26)偶聯As2O3對C6 腦膠質瘤細胞體外生長的抑制作用，為臨床應用奠定實驗基礎。

1材料與方法

1.1　材料

日本關西醫科大學提供的大鼠C6腦膠質瘤細胞株；As2O3注射液(哈爾濱醫科大學伊達制藥廠)；注射級大豆卵磷脂(上海太偉藥業)；膽固醇、維生素E粉、葡聚糖聚50水凝膠(Sigma 公司)；溴化二甲噻唑二苯四氮唑藍(MTT)、多聚賴氨酸、二甲基亞砜購自Sigma公司；DMEM干粉培養基購自Gibco公司；胎牛血清為杭州四季青生物制品公司產品；山羊血清封閉液、DAPI、第一抗體為兔抗GFAP均購于博士德生物工程有限公司；兔抗β-Actin多克隆抗體為上海科興生物科技公司產品，批號A10938R；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗為北京中杉金橋生物技術公司產品，批號A0208；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，IX70-S8F)；酶標儀AD340型( BECKMAN 公司)。

1.2　實驗方法

1.2.1As2O3脂質體制備[1]將卵磷脂、膽固醇和維生素E按照20∶5∶1的比例稱量，放置于茄形瓶，加入適量氯仿溶解，均勻混合，40 ℃減壓旋轉蒸發；精密稱取適量As2O3，于去離子水中加熱溶解，制成溶度為1 mg/mL的As2O3溶液，將該溶液加入上述磷脂和膽固醇脂質膜的茄形瓶中，旋轉水化15 min，冰浴超聲，得到As2O3脂質體溶液，通過具體的超聲時間和強度制成粒徑為0.25～1 μm的單層脂質體。As2O3脂質體的包封率參照《中華人民共和國藥典》采取銀鹽法測定[2]。

1.2.2OX26偶聯As2O3免疫脂質體制備將轉鐵蛋白受體抗體 OX26 按照 Traut's 試劑盒的實驗步驟巰基化，將As2O3脂質體凍干產品以蒸餾水重分散，加入巰基化的 OX26，室溫下氮氣保護進行偶聯反應，得到OX26偶聯As2O3免疫脂質體制備。

1.2.3C6腦膠質瘤細胞培養及處理[3]用含10 ml/L新生牛血清的DMEM培養基培養：C6細胞分裝于培養瓶，加入適量DMEM培養液，置入37 ℃恒溫恒濕培養箱，培養生長至所需的細胞數，在細胞對數生長期大約80%時，用0.25 mL/L胰酶消化，離心，Hank's液吹打制成細胞懸液，接種。苔盼藍排斥試驗檢測細胞活力大于95%，接種前，收獲指數生長期的大鼠C6膠質瘤細胞，加入細胞懸浮，終濃度為每15 μL含2×106個C6膠質瘤細胞，再接種于12孔板或96孔板。

1.2.4實驗分組實驗隨機將培養的C6膠質瘤細胞分為3組：鹽水組，As2O3組和OX26偶聯As2O3脂質體組。分別給予生理鹽水、As2O3液(6 μmol·L-1)和OX26偶聯As2O3免疫脂質(6 μmol·L-1)進行干預；1次/d，3組均干預2周；然后進行相關指標檢測。

1.2.5MTT檢測[4]在腦膠質瘤細胞終止培養前3 h ，每孔加入MTT溶液20 μl，常規繼續培養3 h，吸去孔板內液體，加DMSO液，于搖床輕搖10 min，采用酶標儀在波長492 nm設置下檢測每孔腦膠質瘤細胞OD值。細胞抑制率(%)= [(對照組OD 值-治療組OD 值)/對照組OD 值]×100%。

1.2.6腦膠質瘤細胞凋亡檢測采取細胞核(DAPI)染色法，吸取3組培養板內的液體，分別加入DAPI(1∶1 000)各1 mL，5 min，用PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察和拍照。圖片處理采用C8圖像分析儀，每組細胞隨機選擇10張圖片檢測，每張圖片隨機選取10個視野，記錄每個視野下細胞光密度和面密度值。

1.2.7免疫印跡法檢測無菌條件下細胞經裂解，BCA法蛋白定量，蛋白上樣，進行SDS-PAGE電泳分離，硝酸纖維素膜進行轉膜和封閉，一抗兔抗GFAP(1∶8 000)孵育過夜，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶2 500)孵育，蛋白條帶用化學發光法顯示，膠片顯影、定影；采用β-actin作為內參。圖片分析應用NIH Image軟件。

1.3　統計學方法

2結果

2.1　OX26偶聯As2O3免疫脂質對腦膠質瘤抑制作用

MTT 法檢測顯示：相對于鹽水組，兩組干預后腦膠質瘤細胞的OD值分別為0.72±0.18和0.58±0.12，明顯小于鹽水組(P<0.01)；與As2O3組比較，OX26偶聯As2O3免疫脂質干預對腦膠質瘤生長的抑制率為40.21%，顯著高于As2O3組的25.77%，比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表 1。

表1　OX26偶聯As2O3免疫脂質對腦膠質瘤生長的抑制

2.2　OX26偶聯As2O3免疫脂質促進腦膠質瘤凋亡

核染顯示：相對于鹽水組，兩組干預后，腦膠質瘤細胞的核染色明顯減少。與As2O3干預比較，OX26偶聯As2O3免疫脂質組腦膠質瘤細胞的光密度和面密度值顯著減少，比較有統計學意義(P< 0.01)，見表 2。

2.3　OX26偶聯As2O3免疫脂質對腦膠質瘤細胞GFAP蛋白表達影響

GFAP蛋白Western blot檢測顯示：鹽水組GFAP蛋白表達量較干預組少，而OX26偶聯As2O3免疫脂質組GFAP蛋白表達量最多，見圖1。

表2　OX26偶聯As2O3免疫脂質對腦膠質瘤細胞凋亡的

圖1　蛋白印跡法檢測各組腦膠質瘤細胞中GFAP的表達

3　討論

膠質瘤呈浸潤性分布，手術治療未能將其徹底清除，易復發，且術后的放化療對患者的損害大[5]。探索新的有效治療方法和藥物是亟待解決的臨床難題。

As2O3作為傳統中藥砒霜的有效成份，已廣泛用于臨床白血病手術的化療。但是，單純的砷劑有治療代謝快、效用時間較短等缺點[6]。研究證實，脂質體具有對癌細胞的靶向性高，毒副作用低，藥效高和生物降解性和生物相容性好等特點[1]。脂質體能夠延緩藥物清除，有利于向病變組織分布，且局部靶向作用可極大提高藥物的作用療效[7]。研究表明，轉鐵蛋白受體大量位于腫瘤細胞的表面，是腫瘤靶向轉運的重要靶標[8]。體內內源性轉鐵蛋白的含量較高，與受體的結合接近飽和水平，所以轉鐵蛋白本身并不適合作為轉運體。在本研究中，我們通過合成OX26偶聯As2O3脂質體，極大提高了干預效果。本研究結果顯示，OX26偶聯As2O3脂質體對膠質瘤細胞體外具有明顯抑制作用，且能夠促進膠質瘤細胞的凋亡，上述作用均優于單純的As2O3干預。

研究治療方法和藥物干預對腦膠質瘤細胞的作用機制對臨床治療具有重要價值。GFAP為中間絲蛋白，特異性表達于膠質瘤細胞[9]。膠質瘤細胞GFAP的強陽性表達往往標志著瘤細胞趨向于好[10]。研究進一步發現，GFAP與膠質瘤細胞的分化程度密切相關，即分化程度越差，GFAP表達越少甚至不表達[11]。在本研究中發現，OX26偶聯As2O3脂質體對膠質瘤體外干預后，GFAP蛋白表達較鹽水對照組合單純As2O3作用更多。提示了OX26偶聯As2O3脂質體對膠質瘤細胞體外抑制作用的作用機制。

參考文獻

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(編輯：吳小紅)

Inhibitory Effect of OX26 and As2O3Immunoliposome on Viability of

Glioma Cell in Rats in Vitro

CHENYan,GUOMeihua,HAIXin,etal.TheFirstHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin,150001

【Abstract】ObjectiveTo observe the inhibitory effect of OX26 and As2O3immunoliposome on viability of glioma cell in rats in vitro.MethodsC6 glioma cells were cultured in vitro and divided into saline water group,As2O3group,and combination group of OX26 and As2O3immunoliposome.MTT colorimetric method was used to detect inhibitory effect of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on viability of glioma cells.DAPI staining was used to observe apoptosis of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on glioma cells.Western blot method was used to evaluate expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP) combination of OX26 and As2O3immunoliposome on glioma cells.ResultsMTT method showed inhibitory rate of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on glioma cells was 40.21%,which was higher than As2O3group 25.77%(P<0.05).Compared with saline water group and As2O3group,optical density and areal density of glioma cells in combination group of OX26 and As2O3immunoliposome were obviously decreased by DAPI staining(P<0.01).Western blot method showed that GFAP expression in combination group of OX26 and As2O3immunoliposome was less than saline water group and As2O3group.ConclusionInhibitory effect of combination of OX26 and As2O3immunoliposome on viability of glioma cell rats in vitro is remarkable,and its mechanism may be related with promote apoptosis and GFAP expression of glioma cells.

【Key words】As2O3；OX26；Glioma；Glial fibrillary acidic protein(GFAP)

中圖分類號：R730.264

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)01-0007-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.01.003

通訊作者：張旭

基金項目：作者單位:150001 哈爾濱醫科大學附屬第一醫院

收稿日期(2015-01-09修回日期 2015-05-04)