卷曲螺旋結構域蛋白74B對纖毛生成和細胞周期調控作用研究

李 萍，方 霞，曹雨娜，陸惠娜，梁愛斌，張 虹

·論著·

卷曲螺旋結構域蛋白74B對纖毛生成和細胞周期調控作用研究

李 萍，方 霞，曹雨娜，陸惠娜，梁愛斌，張 虹

【摘要】背景卷曲螺旋結構域蛋白(CCDC)參與基因轉錄、細胞凋亡及細胞周期過程，并調控惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移等多種生物學行為，然而多數CCDC的生物學功能目前尚未明確。目的探討CCDC74B的細胞定位及對纖毛生成和細胞周期的影響。方法2013年3—9月通過構建在人視網膜色素上皮(RPE1)中的Tet-On表達系統,實現CCDC74B在細胞內的蛋白表達,然后通過細胞免疫熒光染色觀察CCDC74B的細胞定位，通過小干擾RNA(siRNA)轉染敲除CCDC74B在RPE1細胞中的表達，分為對照組、siRNA#1組、siRNA#2組，采用反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測CCDC74B mRNA 表達水平；采用細胞免疫熒光染色及流式細胞術觀察下調CCDC74B表達后纖毛生成情況和對細胞周期分布的影響。結果在正常上皮細胞中，CCDC74B位于中心體，細胞免疫熒光染色示，下調CCDC74B表達后細胞初級纖毛生成。siRNA#1組及siRNA#2組轉染后36 h及48 h纖毛生成率分別高于對照組(P<0.05)。RT-PCR法結果顯示,siRNA#1組及siRNA#2組均有效抑制了CCDC74B mRNA表達。細胞免疫熒光染色示，下調CCDC74B表達后cyclin A表達減少，提示存在細胞周期停滯；流式細胞術檢測示，下調CCDC74B表達后G1期細胞比例增高，S期及G2/M期細胞比例減少。結論中心體蛋白CCDC74B在細胞增殖過程中參與對纖毛生成和細胞周期的調控。

卷曲螺旋結構域蛋白(CCDC)是其序列中存在一個或數個卷曲螺旋結構域而被命名的一類蛋白[1]。CCDC結構折疊形式多變，可通過空間構象改變而實現許多不同的分子生物學功能，對細胞再生和存活、在細胞及分子的相互識別過程中起著確定性的作用。已有研究表明，部分CCDC參與基因轉錄、細胞凋亡及細胞周期過程，并調控惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移等多種生物學行為[2-3]。CCDC有百余種，然而多數蛋白生物學功能目前尚未知。本研究首先通過構建在人視網膜色素上皮(RPE1)細胞中的Tet-On表達系統，實現在細胞內的CCDC74B表達，使用細胞免疫熒光染色方法觀察CCDC74B的細胞定位；然后通過小干擾RNA(siRNA)轉染敲除CCDC74B表達后觀察細胞纖毛生成及細胞周期變化情況，以初步探討CCDC74B在細胞中的生物學功能。

1材料與方法

1.1試劑與抗體DMEM/F-12培養基、 胎牛血清、總RNA提取試劑盒、反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑盒及LipofectamineTMLTX轉染試劑盒均為美國Invitrogen公司產品；抗cyclin A抗體、細胞周期碘化丙啶(PI)/RNase染色液為美國BD公司產品；抗Myc抗體(9E10)為瑞士Roche公司產品；抗乙酰化tubulin抗體(6-11B-1)、抗tubulin抗體為美國Sigma公司產品。

1.2細胞系及細胞培養2013年3—9月，RPE1細胞由本實驗室傳代培養。RPE1細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養基中，于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

1.3利用Tet-On表達系統構建穩定表達CCDC74B的RPE1細胞株Tet-On表達系統的構建過程參照Inoko等[4]報道，進行相同操作。具體步驟如下：將CCDC74B DNA亞克隆至pENTR4-Myc載體，構建pENTR4-Myc-CCDC74B質粒，然后再通過LR重組反應將Myc-CCDC74B克隆至Tet應答的慢病毒載體pCSII-TRE-Tight-RfA(從Inakaki教授研究室獲得)。重組后的pCSII-TRE-Tight-RfA-Myc-CCDC74A/B質粒通過慢病毒感染Tet-On RPE1細胞，并使用G418(250 μg/ml)和潮霉素B(50 μg/ml)雙重篩選感染細胞。在細胞株建立后，使用適量多西環素(doxycycline，DOX)誘導CCDC74B在RPE1細胞內的蛋白表達后進行后續實驗。

1.4細胞免疫熒光染色觀察CCDC74B細胞定位、纖毛形成和cyclin A 表達情況將RPE1細胞預培養于底部放置載玻片的培養皿中,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，使用100%甲醇或3.7%甲醛溶液固定細胞,后者固定的細胞需予以0.1% Triton X-100通透5 min。然后予以1%牛血清清蛋白(BSA)封閉1 h后，分別加入抗Myc抗體、抗乙酰化微管蛋白(ac-tubulin)抗體、抗tubulin抗體及抗cyclin A抗體孵育1 h或4 ℃過夜；孵育熒光二抗后，最后用DAPI進行細胞核染色，封固，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.5siRNA合成及計算纖毛生成率從Qiagen公司購買敲除CCDC74B基因兩種不同的siRNA序列#1(siRNA#1組)和#2(siRNA#2組)及control siRNA(對照組)，具體序列如下:siRNA#1:CAGACAGCCTCTCCACGTCAA，siRNA#2:CACGTTACA

AGCTCATAATGA；Control siRNA:TTCTCCGAACGTGTC

ACGT。使用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養液培養RPE1細胞24 h后,適量siRNA與LipofectamineTMLTX及PLUSTM試劑混合后轉染細胞36 h和48 h,觀察纖毛生成情況。觀察100個細胞中纖毛生成個數，計算纖毛生成率。

1.6RT-PCR法檢測CCDC74B mRNA 表達收集siRNA轉染48 h后的RPE1細胞，使用Trizol一步法從細胞中抽提總RNA，取2 μg總RNA通過反轉錄反應合成互補DNA(cDNA)片段，反轉錄體系：(1)OligodT Primer 1 μl,dNTP Mixture 1 μl,RNase free 蒸餾水(dH2O)6.0 μl,RNA 2.0 μg；65 ℃ 5 min；(2)10×RT Buffer 2.0 μl,25 mmol/L氯化鎂(MgCl2) 4 μl,0.1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)2 μl,RNaseOut 1 μl,SuperScript Ⅲ RT 1.0 μl,RNase free dH2O 4.5 μl,50 ℃×50 min,85 ℃×5 min；(3)RNase H 1 μl 37 ℃ 20 min；PCR反應體系為：E×Taq Polymerase 0.25 μl上下游引物(CCDC74B或內參基因GADPH)各2 μl，10×Reaction Buffer 5.0 μl,模板1.0 μl,重蒸水(ddH2O)35.75 μl。PCR反應條件為：98 ℃預變性10 s；98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s,30 個循環。產物進行瓊脂糖凝膠電泳，拍照，觀察。

1.7流式細胞術檢測細胞周期變化收集siRNA轉染48 h后的RPE1細胞，使用Cycle test Plus kit試劑盒，對DNA進行PI染色。待流式細胞儀檢測后，使用CellQuest軟件分析計算各細胞周期的細胞數目。

2結果

2.1細胞免疫熒光染色觀察CCDC74B細胞定位在RPE1細胞中成功構建了表達帶有Myc標記的人類基因CCDC74B(Myc-CCDC74B)的Tet-On表達系統。使用DOX(25 ng/ml)預處理24 h，在誘導Myc-CCDC74B在RPE1細胞中蛋白表達后,使用抗tubulin抗體與抗Myc抗體進行雙重細胞免疫熒光染色觀察到CCDC74B的綠色熒光與tubulin的紅色熒光重合而變色，提示CCDC74B在細胞分裂間期位于中心體(見圖1，本文圖1～4彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

2.2下調RPE1細胞中的CCDC74B表達對細胞纖毛生成的影響細胞免疫熒光染色示，下調CCDC74B表達后細胞初級纖毛生成(見圖2)。siRNA#1組及siRNA#2組轉染后36 h及48 h纖毛生成率分別高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01，見表1)。

2.3RT-PCR法檢測RPE1細胞內CCDC74B mRNA表達轉染RPE1細胞48 h后采用RT-PCR法檢測RPE1細胞內CCDC74B mRNA表達水平,siRNA#1組及siRNA#2組均有效抑制了CCDC74B mRNA表達(見圖3)。

2.4下調CCDC74B表達對細胞周期的影響細胞免疫熒光染色示，下調CCDC74B表達后cyclin A表達減少(見圖4)，提示存在細胞周期停滯；流式細胞術檢測示，下調CCDC74B表達后G1期細胞比例增高，S期及G2/M期細胞比例減少(見圖5)。

3討論

CCDC74B基因位于人類染色體2q21.1,蛋白質序列有一個CCDC結構域，目前尚未見關于該基因生物學功能的文獻報道。由于局限于目前市場上尚無用于細胞免疫熒光染色的該蛋白抗體，本研究通過構建在RPE1細胞中的Tet-On表達系統,使用DOX誘導實現細胞內CCDC74B(Myc-CCDC74B)的穩定表達，然后通過抗Myc抗體的細胞免疫熒光染色法觀察CCDC74B的細胞定位。本研究結果表明，CCDC74B位于中心體。由于中心體蛋白在初級纖毛生成、細胞分裂等細胞生物學行為發揮重要作用，因此本研究進一步探討了CCDC74B對纖毛生成及細胞周期的影響，研究發現,在正常增殖的細胞中，抑制CCDC74B表達后誘導了初級纖毛的生成，提示CCDC74B可能為纖毛生成的負調控因子。

圖1細胞免疫熒光染色觀察Myc-CCDC74B Tet-On RPE1細胞中CCDC74B細胞定位

Figure 1CCCD74B intercellular localization was observed through immunofluorescence in Myc-CCDC74B Tet-On RPE1 cells

圖2　siRNA下調CCDC74B表達后誘導RPE1細胞初級纖毛生成

Figure 2Knockdown of CCDC74B caused primary cilia formation in RPE1 cells

Table 1Comparison of the percentages of ciliated cells observed 36 and 48 hours after transfection among control group,siRNA#1 group and siRNA#2 group

組別36h48h對照組4.3±0.63.3±1.2siRNA#1組38.3±2.1a35.3±2.5asiRNA#2組64.0±6.2a59.3±3.8aF值184.634322.909P值<0.001<0.001

注：siRNA=小干擾RNA；與對照組比較，aP<0.01

圖3　CCDC74B mRNA表達電泳圖

圖4細胞免疫熒光染色檢測CCDC74B表達下調后細胞cyclin A表達情況

Figure 4Expression of cyclin A after the decrease of CCDC74B expression observed by immunofluorescence staining

圖5　流式細胞術檢測CCDC74B表達下調后細胞周期分布情況

Figure 5Cell cycle distribution after the decrease of CCDC74B expression detected by FCM

初級纖毛幾乎存在于所有的人類細胞類型中，是突出細胞表面的“毛發狀”細胞器，由中心體一中心粒(即母中心粒)轉化成基體而形成。初級纖毛和細胞周期有著密切的聯系。當細胞退出細胞周期，進入G0期，纖毛則出現；而當靜止細胞進入細胞周期，纖毛則被吸收，并在細胞增殖過程中不再出現，這種吸收利于釋放中心體，使其形成紡錘體極，保證染色體在細胞分裂時的精確分離[5-6]。然而，在細胞增殖過程中纖毛形成受抑制的調控機制目前尚不明確。研究發現，Aurora A激酶在G0/G1期通過在基體部位和HEF1結合，特異性激活 HDAC6的微管蛋白去乙酰化活性，導致纖毛軸絲的解體[7]。Inoko等[4]研究發現，多毛蛋白Trichoplein與Aurora A激酶結合，在細胞增殖中抑制纖毛的生長。另一研究發現，CP110在Cep97和Kif24的作用下在細胞分裂間期位于母中心粒末端，抑制纖毛的生長，機制可能是通過和Cep290結合，抑制Rab8a在纖毛形成中的功能[8-9]。最新研究表明，S/G2期激酶Nek2可通過對 Kif24磷酸化改變其活性而抑制纖毛的生成[10]。CCDC74B則是本研究首次報道的在增殖細胞中抑制纖毛生成的另一個調控蛋白，但其具體作用機制尚需進一步研究。

近年研究發現，在一些增殖細胞中初級纖毛的異常出現或長度異常能阻滯細胞周期[4,7,11-12]，提示纖毛本身也是調控細胞周期的“制動器”。 細胞無限制地增生是惡性腫瘤的重要特性之一，而且在許多類型惡性腫瘤細胞中不存在纖毛，因此在腫瘤細胞中誘導纖毛生長的治療方法有望成為某些類型惡性腫瘤治療的新途徑。最近已有研究發現，在原代人類膽管癌細胞及乳腺癌細胞中誘導纖毛的生成能夠顯著抑制腫瘤細胞的生長[10,13]。 本研究發現，下調CCDC74B表達也導致了G1期停滯，與上述文獻報道的表型一致，提示CCDC74B下調所致的細胞周期停滯可能與初級纖毛生成相關。

綜上所述，在正常增殖細胞中，CCDC74B位于中心體，下調CCDC74B表達誘導了初級纖毛的生成，并致細胞周期停滯于G1期，提示中心體蛋白CCDC74B可能通過對纖毛生成的調控參與細胞增殖過程。本研究中筆者揭示了CCDC74B在纖毛生成和細胞周期調控方面的生物學功能，也為纖毛相關性疾病的機制和治療提供了相關線索。

作者貢獻：李萍進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；方霞、曹雨娜、陸惠娜進行實驗實施、評估、資料收集；梁愛斌、張虹進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

【關鍵詞】卷曲螺旋結構域蛋白；纖毛；細胞周期；細胞增殖

李萍，方霞，曹雨娜，等.卷曲螺旋結構域蛋白74B對纖毛生成和細胞周期調控作用研究[J].中國全科醫學，2016，19(3)：292-295.[www.chinagp.net]

Li P，Fang X,Cao YN,et al.Regulatory effect of CCDC74B on cilia formation and cell cycle[J].Chinese General Practice，2016，19(3)：292-295.

Regulatory Effect of CCDC74B on Cilia Formation and Cell CycleLIPing，FANGXia,CAOYu-na,etal.DepartmentofHematology,TongjiHospitalofTongjiUniversity,Shanghai200065,China

【Abstract】BackgroundCCDC protein is involved in various biological behaviors including gene transcription,apoptosis,cell cycle and regulating invasion and metastasis of cancer cells.However,most CCDC protein functions remain unknown.ObjectiveTo investigate the cellular localization and its influence on cilia formation and cell cycle.MethodsFrom March to September in 2013,Tet-On expression system of RPE1 was built,and protein expression of CCDC74B was realized.The localization of exogenous CCDC74B was observed by immunofluorescence.After siRNA transfection was performed to decrease endogenous CCDC74B protein expression in RPE1 cells,the cells were divided into control group,siRNA#1 group and siRNA#2 group.RT-PCR method was used to detect CCDC74B mRNA expression.Cilia formation and cell cycle distribution after the decrease of CCDC74B expression were further observed by immunofluorescent staining and flow cytometry.ResultsIn normal epithelial cells,CCDC74B was in centrosome,and immunofluorescent staining showed that the decrease of CCDC74B leaded to the elementary cilia formation.36 h and 48 h after transfection,siRNA#1 group and siRNA#2 group were higher than control group in the proportion of ciliated cells(P<0.05).RT-PCR method showed that siRNA#1 group and siRNA#2 group effectively inhibited the expression of CCDC74B mRNA.The immunofluorescent staining showed that after the decrease of CCDC74B expression,the expression of cyclin A decreased,which suggested that cell cycle arrest may exist.FCM suggested that the decrease of CCDC74B leaded to the increase of the proportion of G1cells and the decrease of the proportion of cells at S and G2/M phrases.ConclusionCentrosomal protein CCDC74B is involved in the regulation of cilia formation in the process of cell proliferation.

【Key words】Coiled-coil domain containing；Cilia；Cell cycle；Cell proliferation

(收稿日期：2015-08-10；修回日期：2015-12-15)

【中圖分類號】R 349.53

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.03.010

通信作者:張虹，200065 上海市，同濟大學附屬同濟醫院血液科；E-mail：hongzh97@sina.com

基金項目:國家自然科學基金資助項目(31301118)
作者單位：200065 上海市，同濟大學附屬同濟醫院血液科