沙利度胺對子宮內膜異位癥患者內膜間質細胞的影響及其機制▲

李 寧 彭 興 黎丹戎 堯良清 黃玉葵 范余娟

(1 廣西南寧市婦幼保健院婦科，南寧市 530001，E-mail：lining0771@163.com；2 廣西醫科大學藥學院，南寧市 530021；3 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院腫瘤實驗研究中心，南寧市 530021；4 復旦大學附屬婦產科醫院婦科，上海市 200011；5 廣西醫科大學第一附屬醫院婦科，南寧市 530021)

論著·基礎研究

沙利度胺對子宮內膜異位癥患者內膜間質細胞的影響及其機制▲

李 寧1彭 興2黎丹戎3堯良清4黃玉葵1范余娟5

(1 廣西南寧市婦幼保健院婦科，南寧市 530001，E-mail：lining0771@163.com；2 廣西醫科大學藥學院，南寧市 530021；3 廣西醫科大學附屬腫瘤醫院腫瘤實驗研究中心，南寧市 530021；4 復旦大學附屬婦產科醫院婦科，上海市 200011；5 廣西醫科大學第一附屬醫院婦科，南寧市 530021)

目的 探討沙利度胺對子宮內膜異位癥(EMT)患者內膜間質細胞(ESC)的增殖、遷移運動、修復及體外侵襲能力的影響及其作用機制。方法 體外原代培養EMT患者的ESC，加入不同濃度沙利度胺(500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/ml)分別作用24 h、48 h后，應用噻唑藍法測定ESC的抑制率。另取ESC分為空白組(沙利度胺0 μg/ml)、15 μg/ml沙利度胺組、30 μg/ml沙利度胺組，分別應用劃痕實驗、Transwell小室實驗測定沙利度胺對ESC遷移運動及修復能力、體外侵襲能力的影響，流式細胞儀檢測在沙利度胺作用24 h后ESC的凋亡率，酶聯免疫吸附試驗實驗檢測沙利度胺對ESC血管內皮生長因子(VEGF)蛋白表達的影響。結果 15、30 μg/ml沙利度胺組細胞的遷移及修復能力、穿膜細胞數較空白組下降，細胞凋亡率較空白組升高(P<0.05)；細胞抑制率隨沙利度胺作用的濃度升高而升高(P<0.05)；15、30 μg/ml沙利度胺組細胞VEGF蛋白表達量明顯低于空白對照組(P<0.05)。結論 沙利度胺可抑制人EMT患者ESC的增殖、遷移運動和體外侵襲能力，并可以誘導細胞凋亡，其機制可能是下調細胞VEGF蛋白分泌。

子宮內膜異位癥；沙利度胺；內膜間質細胞；血管內皮生長因子；細胞增殖；遷移；侵襲

子宮內膜異位癥(endometrionsis，EMT)的發病率為10%～15%。異位內膜極具浸潤性及種植能力，可侵犯全身任何部位，患者可出現痛經、盆腔痛、性交痛，甚至不孕等，嚴重影響患者的身心健康和生活質量[1-2]。藥物治療是EMT的主要治療方法，臨床上多采用激素類藥物進行治療，但存在療效不理想、副作用大的弊端，因此，尋找非激素類的治療藥物意義重大[3]。大量文獻報告EMT雖為婦科良性疾病，卻與惡性腫瘤具有相似的黏附、侵襲、遠處轉移及新生血管生成等生物學特性[4-5]。因此，抗血管生成有可能成為治療EMT的新趨勢。沙利度胺具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，其機制可能是抑制新生血管的形成[6]。為探討沙利度胺對子宮內膜異位癥內膜間質細胞(endometrionsis-endometrial stromal cell，EMT-ESC)的影響，本課題對EMT患者的內膜間質細胞(endometrial stromal cell，ESC)進行體外培養，將沙利度胺作為主要干預因子，觀察其對細胞的影響。

1 資料與方法

1.1 細胞來源 選擇2013年1月至2015年1月在南寧市婦幼保健院婦科就診的EMT患者31例為研究對象，患者年齡29～40(32.0±1.7)歲，術前無激素用藥史，術后經病理檢查明確診斷。術中留取患者卵巢巧克力囊腫的囊壁進行原代EMT-ESC培養。

1.2 方法

1.2.1 主要藥品及儀器：沙利度胺購自常州制藥廠有限公司(批號020126)。稱取沙利度胺藥物粉末25 mg，加入5 ml無血清RPMI-1640培養基使其充分溶解，經0.22 μm無菌濾膜過濾即得5 mg/ml藥物原液，分裝，于4℃保存，使用時采用無血清RPMI-1640培養基稀釋藥物原液至所需濃度。鼠抗人波形蛋白抗體購自武漢博士德公司(批號：130106025A)；倒置顯微鏡為日本Nikon公司生產；噻唑藍(methyl thiazol tetrazolium，MTT)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-熒光標記二抗、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司(批號：13031311M、12112618M、12120928M)；血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自美國Abcam公司(批號：130520631H)；Transwell小室購自美國Chemi-Con公司(批號：1300165)；DMEM細胞培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司(批號：130412P、130325X)；流式細胞儀為美國BD公司生產。

1.2.2 原代細胞培養：術中取少量新鮮EMT組織(巧克力囊腫的囊壁)，臨時儲存于完全培養基中，并及時轉移到實驗室，處理步驟如下：將部分人EMT組織經磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗后，用眼科手術剪刀小心地反復剪切組織至1 mm3左右的小塊，再用PBS溶液清洗至清洗液清亮，靜置數分鐘，棄去上清。視組織塊量加入5～6倍的0.25%胰酶液，37℃消化30 min，每隔5 min振蕩一次。靜置，吸去上清，加2 ml細胞培養液，用吸管反復吹打組織塊，使細胞呈單個游離狀，將細胞懸液接種至T 25培養瓶中，置于37℃、二氧化碳培養箱中培養。倒置顯微鏡下觀察原代培養細胞的形態及生長情況。用鼠抗人波形蛋白抗體對分離獲得細胞進行免疫組化染色鑒定[3]，鑒定后的細胞用于后續實驗。

1.2.3 MTT實驗：取對數生長期的ESC，以1×105/ml密度接種于96孔板中，每孔100 μl，37℃培養24 h后，加入100 μl不同濃度沙利度胺(500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/ml)，空白孔加100 μl細胞培養液，每組設4個復孔。37℃分別培養24、48 h后每孔加20 μl MTT，37℃繼續孵育4 h，小心吸棄孔板中的所有試劑，加入200 μl DMSO，10 min后在酶標儀上測定波長570 nm吸光度值(A)，按公式計算抑制率及半數抑制濃度IC50。抑制率=(1-實驗組A值/空白對照組A值)×100%[7]。選擇抑制率小于10%的濃度，觀察沙利度胺對細胞增殖活力的影響。

1.2.4 細胞劃痕實驗：取對數生長期的ESC，將細胞濃度調整至1×106/ml，于6孔板中每孔加細胞懸液500 μl，37℃、5% CO2孵育24 h，使之形成單層細胞。10 μl無菌移液槍槍頭劃痕，PBS溶液輕柔洗細胞3次。加入不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)，37℃、5% CO2孵育，按0 h、24 h、48 h、72 h取樣，顯微鏡觀察、拍照。

1.2.5 Transwell小室實驗：取對數生長期的ESC，將細胞濃度調整至5×104/ml，取細胞懸液200 μl接種于上層小室內，小室下室加入含有20%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基。各組Transwell小室加入不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)，37℃、5% CO2孵育24 h后取出濾膜，擦去Matrigel膠，甲醇固定20 min，行Giemsa染色。200倍光鏡下隨機計數上、下、左、右、中5個不同視野的穿膜細胞數，取均值。實驗重復3次。

1.2.6 檢測細胞凋亡率：用Sigma公司的細胞染色緩沖液洗滌細胞兩次，然后懸浮細胞在膜聯蛋白V結合緩沖液中，細胞濃度為0.8×107/ml。移取100μl細胞懸液放于5 ml的試管中，給藥組分別加入不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)，以不加藥物的細胞為對照組。24 h后收集細胞，調整細胞濃度為1×106/ml，每根試管中加入490 μl工作濃度的膜聯蛋白V結合緩沖液，振蕩混勻細胞，同時加入5 μl膜聯蛋白V-FITC和1 μl 7-氨基放線菌素D，室溫下避光染色10 min，用流式細胞儀進行雙參數分析，測定壞死、凋亡和正常細胞的百分率。

1.2.7 VEGF蛋白表達的測定：取對數生長期的ESC，調整細胞濃度為5×105/ml，將ESC置培養瓶中培養，細胞貼壁后加入不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)處理24 h，更換成無血清及細胞因子的基礎培養基培養24 h，收集細胞培養上清液。采用酶聯免疫吸附試驗法對細胞培養上清中VEGF含量進行測定。設置空白孔，將上述收集到的細胞培養上清液按100 μl/孔加入相應預包被板孔中，用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育120 min。加入生物素化抗體工作液(100 μl/孔)。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育60 min。加入酶結合物工作液(100 μl/孔)。用封板膠紙封住反應孔，避光室溫孵育20 min。上述每個步驟之間均洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。加入顯色劑3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺100 μl/孔，避光室溫孵育20 min。加入終止液50 μl/孔，混勻后即刻通過酶標儀測量A450值。VEGF濃度與A450值之間呈正比。

1.3 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，計量資料以(x±s)表示，多組均數比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 原代培養EMT患者ESC形態及鑒定結果 成功從EMT患者巧克力囊腫標本分離培養子宮ESC，細胞容易貼壁生長。倒置顯微鏡下觀察原代人EMT-ESC呈蝌蚪形或多角形，細胞多呈旋渦狀成團生長，見圖1。免疫組化鑒定結果顯示，原代細胞具有成纖維細胞形態，鼠抗人波形蛋白染色細胞胞質呈棕黃色，證實獲得人EMT-ESC，見圖2。

圖1 原代培養細胞(×200)圖2 原代培養細胞鼠抗人波形蛋白染色結果(×200)

2.2 沙利度胺對EMT患者ESC增殖能力的影響 不同濃度沙利度胺對人EMT-ESC的抑制率分別比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，不同濃度的沙利度胺均能顯著抑制細胞的生長，且呈明顯的劑量-時間依賴性(P<0.05)。24 h、48 h沙利度胺對人EMT-ESC的抑制率IC50分別為245.44 μg/ml和185.36 μg/ml，當沙利度胺濃度低于30 μg/ml時，對細胞的生長抑制率低于10%。見表1。

表1 不同濃度的沙利度胺作用24 h、48 h人EMT-ESC的抑制率(%)

注：*組內不同濃度間兩兩比較，P<0.05。

2.3 沙利度胺對EMT患者ESC遷移能力的影響 不同濃度的沙利度胺(0、15、30 μg/ml)處理細胞0 h、24 h、48 h、72 h后，細胞劃痕實驗結果顯示沙利度胺能明顯抑制細胞的遷移運動及修復能力，且呈明顯的劑量-時間依賴性。見圖3。

圖3 不同濃度沙利度胺作用不同時間ESC遷移運動、修復能力的變化(×100)

2.4 沙利度胺對EMT患者ESC侵襲能力的影響 空白組和15、30 μg/ml沙利度胺組的穿膜細胞數目分別為(79.3±6.5)個、(11.5±3.6)個和(6.5±2.4)個，沙利度胺處理24 h后的人EMT-ESC體外侵襲能力顯著降低(F=2 268.127，P<0.001)，見圖4。

圖4 不同濃度沙利度胺作用24 h對細胞體外侵襲能力的影響 (Giemsa染色，×200)

2.5 沙利度胺對EMT患者ESC凋亡的影響 經15 μg/ml和30 μg/ml沙利度胺作用24 h后的細胞凋亡率分別為14%和29%，顯著高于空白組的0.3%，見圖5。

圖5 不同濃度沙利度胺作用24 h后細胞的凋亡情況

2.6 沙利度胺對VEGF蛋白表達的影響 作用24 h后，15、30 μg/ml沙利度胺組細胞VEGF蛋白表達量分別為(42.34±4.50)ng/L、(28.70±3.23)ng/L，明顯低于空白對照組的(61.56±7.32)ng/L(F=243.635，P<0.001)。

3 討 論

有學者研究發現，與子宮內膜接觸的腹膜部分，其表面間質細胞會出現缺失現象，這與子宮內膜發生侵襲的現象相符合[7]，由此可見子宮ESC是一種具侵襲能力的細胞，可以引起腹膜間質細胞的損傷和凋亡。子宮ESC生長和轉移離不開血管生成，新生血管形成是子宮ESC增長所必需的先決條件之一。血管增生在EMT的發病機制中起著較為關鍵的作用。大多數EMT患者存在子宮內膜增厚、毛細血管豐富的典型病理學特征，組織病理學檢查也可見到迂曲、擴張的毛細血管。有文獻報告病變的子宮ESC VEGF分泌量明顯增高，并通過旁分泌作用促進微血管增生[8]。目前治療EMT的常用藥物有芳香酶抑制劑、促性腺激素釋放激素拮抗劑、選擇性孕激素受體調節劑[9-10]。而針對血管形成的抑制藥物鮮有報告。因此，篩選可抑制VEGF的表達及異位病灶的微血管生成，促進異位內膜細胞萎縮壞死，從而抑制EMT發展的血管生成抑制劑，將為EMT的治療提供新的途徑。

早在20世紀90年代就有學者發現沙利度胺具有抑制血管生成的作用[11]。有學者者認為，沙利度胺抗血管生成的作用取決于其對VEGF及堿性成纖維細胞生長因子的影響。有學者在多發性骨髓瘤治療方法的探索性研究中發現，沙利度胺能夠減少骨髓瘤間質細胞VEGF的分泌[12]。此外，還有研究表明，沙利度胺不僅能夠降低細胞分泌VEGF水平，而且可以通過抑制VEGF的蛋白表達，進一步抑制細胞的遷移、毛細血管的生成及血管的形成[13]。本研究結果顯示，不同濃度沙利度胺組細胞的凋亡率升高，遷移及修復能力、穿膜細胞數、細胞VEGF表達量較空白組下降(P<0.05)，且隨著沙利度胺濃度升高，細胞抑制率升高(P<0.05)，提示人EMT患者ESC經沙利度胺處理后，細胞的增殖、遷移運動、修復及體外侵襲能力均明顯下降，特別是細胞分泌的VEGF水平明顯減少，與上述研究結果相符。筆者推測沙利度胺對EMT患者ESC的生長抑制作用，有可能是通過抑制血管生成的作用而實現的。

[1] 鄭婷萍,孫愛軍,郎景和,等.北京協和醫院住院患者不孕癥與子宮內膜異位癥30年變化趨勢[J].中華婦產科雜志,2015,50(8):591-595.

[2] 冷金花,戴 毅.子宮內膜異位癥診治熱點問題[J].中國實用婦科與產科雜志,2014,30(1):17-20.

[3] 郭 永,趙愛華,蘇 晨,等.米非司酮抑制人子宮內膜基質細胞增殖[J].生殖醫學雜志,2014,23(6):475-479.

[4] Laschke MW,Giebels C,Menger MD.Vasculogenesis:a new piece of the endometriosis puzzle[J].Hum Reprod Update,2011,17(5):628-636.

[5] Wu J,Ng J,Christos PJ,et al.Chronic thalidomide and chemoembolization for hepatocellular carcinoma[J].Oncologist,2014,19(12):1 229-1 230.

[6] Sundqvist J,Andersson KL,Scarselli G,et al.Expression of adhesion,attachment and invasion markers in eutopic and ectopic endometrium:a link to the aetiology of endometriosis[J].Hum Reprod,2012,27(9):2 737-2 746.

[7] Huang F,Cao J,Liu Q,et al.MAPK/ERK signal pathway involved expression of COX-2 and VEGF by IL-1β induced in human endometriosis stromal cells in vitro[J].Int J Clin Exp Pathol,2013,6(10):2 129-2 136.

[8] Xu H,Zhang T,Man GC,et al.Vascular endothelial growth factor C is increased in endometrium and promotes endothelial functions,vascular permeability and angiogenesis and growth of endometriosis[J].Angiogenesis,2013,16(3):541-551.

[9] Xiong W,Zhang L,Yu L,et al.Estradiol promotes cells invasion by activating β-catenin signaling pathway in endometriosis[J].Reproduction,2015,150(6):507-516.

[10]姜 濤.子宮內膜異位癥患者腹腔鏡術后應用GnRH-與孕三烯酮的臨床效果比較[J].山東醫藥,2014,54(26):36-38.

[11]Kruse FE,Joussen AM,Rohrschneider K,et al.Thalidomide inhibits corneal angiogenesis induced by vascular endothelial growth factor[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,1998,236(6):461-466.

[12]Li X,Liu X,Wang J,et al.Thalidomide down-regulates the expression of VEGF and bFGF in cisplatin-resistant human lung carcinoma cells[J].Anticancer Res,2003,23(3B):2 481-2 487.

[13]王達安,林逸心,王 崢,等.沙利度胺抑制TGF-β1誘導的HELF細胞中結締組織生長因子基因啟動子的激活[J].中國病理生理雜志,2014,3(4):693-697.

Effects of thalidomide on endometrial stromal cells in patients with endometriosis and its mechanism

LINing1,PENGXing2,LIDan-rong3,YAOLiang-qing4,HUANGYu-kui1,FANYu-juan5

(1DepartmentofGynaecology,theMaternalandChildHealthHospitalofNanning,Nanning530001,China;2SchoolofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;3ExperimentalCenterforTumorResearch,theAffiliatedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;4DepartmentofGynaecology,GynaecologyandObstetricsHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200011,China;5DepartmentofGynaecology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To explore the effects of thalidomide on the proliferation,migration motion,repair and invasive ability in vitro of endometrial stromal cells(ESCs) in patients with endometriosis(EMT) and its mechanism.Methods The ESCs of patients with EMT primarily cultured in vitro,and were treated with various concentrations(500.00,250.00,125.00,62.50 and 31.25 μg/ml) of thalidomide for 24 and 48 hours respectively.Methyl thiazolyl tetrazolium method was used to detect the inhibition rate of ESCs.Another ESCs were divided into blank group(0 μg/ml thalidomide),15 μg/ml thalidomide group and 30 μg/ml thalidomide group.Scratch-wound assay and Transwell assay were used to determine the effects of thalidomide on the abilities of migration motion and repair,and invasive ability in vitro of ESCs respectively.The apoptosis rates of ESCs were analyzed by flow cytometry after 24 hours of intervention with thalidomide.The effect of thalidomide on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) protein of ESCs was detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Results Compared to the blank group,the abilities of migration and repair,transmembrane cells decreased and cell apoptosis rate increased in the 15 and 30 μg/ml thalidomide groups(P<0.05).The cell inhibition rate was elevated with the increase of the intervention concentration of thalidomide(P<0.05).The expression of VEGF protein in the 15 or 30 μg/ml thalidomide groups was significantly lower than that in the blank control group(P<0.05).Conclusion Thalidomide can inhibit the abilities of proliferation and migration motion,and invasive ability in vitro of ESCs in patients with EMT,and can induce the cell apoptosis.And the mechanism may be related to down-regulation of the secretion of VEGF protein in cells.

Endometriosis,Thalidomide,Endometrial Leydig′s cell,Vascular endothelial growth factor,Cell proliferation,Migration,Invasion

廣西科學研究與技術開發計劃(桂科攻12300016)；廣西南寧市科技局項目(20133174)

李寧(1978～)，女，碩士，副主任醫師，研究方向：子宮內膜異位癥的基礎及臨床。

彭興(1979～)，女，碩士，講師，研究方向：藥物化學，E-mail：625025109@qq.com。

R 711.71

A

0253-4304(2016)08-1062-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.08.03

2016-03-23

2016-06-12)