分子技術在臨床微生物檢驗中的應用

李美麗

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分子技術在臨床微生物檢驗中的應用

李美麗

【摘要】隨著分子技術在現代社會的廣泛應用，微生物檢驗逐漸提高到了一個新的水平，分子技術已逐漸成為臨床診斷的主要依據。作為一門實踐性較強的學科，臨床微生物要求微生物檢驗人員理論與實踐相結合，結合臨床實踐。文章簡要介紹了分子技術在微生物檢驗中的應用，主要包括PCR技術、核酸探針技術、基因芯片技術和其它相關的分子技術在微生物檢驗中的應用，使得分子技術在臨床微生物檢驗中發揮最大的作用，更好的應用于臨床。

【關鍵詞】分子技術；微生物檢驗；聚合酶鏈反應；核酸

With the wide application of molecular techniques in modern society，microbiological testing is gradually raised to a new level，molecular technology has gradually become the main basis for clinical diagnosis. As a practical strong discipline，clinical microbiology requires inspectors to combine theory with practice. This article briefly describes the application of molecular techniques in microbiological testing，including PCR technology，nucleic acid probes，gene chip technology and other related molecular techniques in microbial testing of such molecular techniques to maximize the clinical microbiological testing of action，better clinical application.

【Key words】Molecular techniques，Microbiology inspection，Plolymerase chain reaction，Nucleic acid

作為21世紀的主導技術之一，分子技術發展越來越迅速，且更廣泛地應用于微生物檢驗，使得一些病原微生物能從RNA、DNA的水平上檢測出來，這就在一定程度上減輕了醫務工作者的負擔。聚合酶鏈反應（plolymerase chain reaction，PCR）技術，能對病毒基因進行快速診斷、對病原微生物進行鑒定，同時，在篩查腫瘤方面也較好，因此得到了廣泛的推廣運用［1］。核酸探針技術比較廣泛用于病原菌檢測，又快又敏感，且精準［2］。基因芯片技術能快速檢測多種待檢產品，信息量相對較大，通量也相對較高，因此對于病原菌的檢測具有獨特優勢。通常的傳統微生物檢驗技術，主要根據微生物存在狀態進行分類。由于同一種生物在其生理生化性狀及形態都存在差異，這些方法存在一定誤差，因此很難準確鑒定。現如今，由于其迅速發展的速度，分子技術已經廣被接受，且越來越多通過一些研究，將微生物放在核酸水平上進行考慮，并對其結果進行鑒定。其鑒定結果更具備說服力，究其原因，是因為分子技術具有與其它不同的特點，包括快速、簡便、可靠、高效，而這些傳統的微生物檢驗方法不具備此特點。現在探討核酸探針、PCR及基因芯片等分子技術在微生物檢驗中的最新應用研究，從而為相關研究奠定基礎。

1　PCR技術

PCR，即聚合酶鏈式反應，是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，其最大特點，是能大幅增加微量的DNA。因此，無論是兇殺案中兇手所遺留的皮膚、毛發或血液，或是歷史人物的殘骸、化石中的古生物，只要能分離出相對較少的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是“微量證據”的威力之所在。PCR的設想最初是由美國Mullis在1983年首次提出，隨著1985年聚合酶鏈反應的問世，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到2013年，PCR已發展到第三代技術。1973年，臺籍科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

PCR作為一種新興的分子技術，兼具應用廣、發展快、生命力強大等特點，通過進一步的研究，研究人員逐漸推導出聚合酶鏈式反應技術的特性和原理，并經過多年的發展，使得該技術得到進一步完善。不僅如此，研究學者經過長時間的研究，發掘出其它的相關用途，比如，連接酶鏈反應是依賴核酸序列的擴增、轉錄依賴擴增系統以及免疫PCR等［3］。隨著時間的發展，到了20世紀末，我國便已經開始將PCR技術應用在病原微生物檢驗中，如檢驗獲得免疫性病毒、性病致病菌、肝炎病毒等［4］。

雖然PCR技術比較先進，但也存在一些問題，比如形成引物二聚體、出現假陽性、RNA病毒的PCR檢測操作繁瑣等。這些問題的出現，讓更多專家學者不得不再次對其進行研究，為了彌補其不足，通過不斷的研究，一些新的PCR技術逐漸衍生出來并被用于實踐，如巢式PCR、熱啟動PCR、限制性長度多態性分析（RFLP）、通用引物PCR、隨機引物DNA 多態性擴增（RAPD）、多重PCR、逆轉錄PCR、實時熒光PCR（real-time PCR）等［5］。

綜上所述，PCR技術盡管會有缺點，但將來仍有可能改變微生物檢驗的發展，這種發展，不再僅僅局限于生理特性及外部形態結構，而是讓微生物檢驗發展成為分子水平以上的確診。

2　核酸探針技術

所謂核酸探針，主要是指帶有標記的特異DNA片段，通過一些固定的原則（如堿基互補配對），讓其與目的DNA進行雜交，最后再用特定的方法測定標記物［4］。常見的探針標記的方式主要有非放射性標記及放射性標記，而前者目前應用較多，較為準確與直觀［6］。例如，生物素-抗生物素蛋白系統標記的探針目前的應用越來越受到廣大研究學者的歡迎，已在一些相應的檢測中得到了應用，主要的檢測指標包括乙型肝炎病毒、產腸毒素大腸桿菌以及沙門氏菌的檢測［7］。

現如今，核酸探針在微生物檢驗領域的應用，主要包括：（1）用于流行病學調查研究，區分無毒及有毒菌株；（2）用于檢測不能進行生化鑒定、無法培養、以及缺乏診斷抗原等病原體的檢測；（3）檢測細菌內之間的抗藥基因；（4）用于檢測病毒病，如檢測獲得免疫性缺陷病毒、肝炎病毒；（5）用于分析食品是否會被某些耐藥菌株污染，判定食品污染的特性。相關學者以啤酒腐敗菌中厭氧菌Pectinatus的16SrRNA作為靶分子設計寡核苷酸探針，利用熒光標記檢測啤酒是否發生污染。

3　生物芯片技術

生物芯片技術是20世紀90年代中期以來最具影響的學科之一，作為融合多種尖端科學（生物學、微電子學、計算機科學等）的技術。生物芯片技術主要以玻片為載體，以生物活性分子為排列序列，經過排列組合，可以起到同時檢驗多種疾病的目的。基于其準確高效的特點，基因芯片技術現如今已逐漸運用到有關基因系列，且越來越多地被運用到病原菌感染的研究中［8］。

基因芯片技術具有如下優勢：首先，基因芯片技術檢驗特性更加準確，通過各種不同的方法，可將其它方法檢驗不出的一些問題檢驗出來，時效性較高，已經廣泛運用于基因序列的分析、病原微生物感染的快速診斷、病原菌變異及耐藥機制的研究。其次，基因芯片技術具有檢驗抗體產生之前的感染的特性，因此針對有無感染的情況，通過檢驗便知。同時，基因芯片技術具有更高效的檢驗特性，能夠直接且快速地確定病原體的類型。傳統的檢測技術無法有效獲得患者的精確信息，因此醫生會由于諸類原因而無法有效的進行治療［9］。隨著醫療技術及基因芯片技術的不斷完善和發展，在不久的姜磊眾多的微生物全基因序列將得到測定，人們或許能在一張芯片上檢測出所有的病原菌。

4　其它分子技術

除上述分子技術，隨著分子技術的發展，越來越多的分子技術孕育而生。DNA分子標記技術、ATP生物發光法、氣相色譜法、高效液相色譜法等，讓微生物檢驗得到了更高的精準度與效率。目前，分子技術的發展方向主要集中于高度自動化、高度特異性及高度靈敏性［8］，使得各個技術之間的局限被打破，且能更好與其它學科進行交叉并融合，從而將檢驗的范圍擴展；同時，隨著新分子技術的不斷孕育，分子技術在微生物檢驗中的應用也隨之變得越來越廣泛［10］。

5　結語

綜上所述，分子技術在微生物檢驗中的運用變得逐漸廣泛，現在分子技術的種類不斷增加，各個方法之間，有優勢，也有不足。在實際的臨床應用中，要想鑒定一個新的菌株，除了利用不同分子技術外，還要綜合各項鑒定結果，系統地從生理生化特征等方面逐一進行鑒定，才能更好的確定菌株的分類與歸屬。分子技術能提高臨床微生物檢驗的精準度，提高檢驗效率。

參考文獻

［1］路則寶，白現廣. 分子生物學技術在微生物檢驗中的應用研究進展［J］. 紅河學院學報，2013，11（2）：61-63.

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［7］倪語星. 關注分子技術在臨床微生物檢驗中的應用［J］. 檢驗醫學，2014，29（6）：581-583.

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［9］周昭彥，胡必杰，鮑容，等. MALDI-TOF質譜快速鑒定非結核分枝桿菌方法的建立和評價［J］. 中華檢驗醫學雜志，2013，36 （7）：610-614.

［10］戴穎欣，李敏. MALDI-TOF MS在臨床微生物檢驗中的應用［J］.檢驗醫學，2015，30（2）：102-107.

Application of Molecular Techniques in Clinical Microbiology Inspection

LI Meili Clinical Laboratory，Liaoning Provincial Tumor Hospital of Anshan City，Anshan Liaoning 114034，China

【Abstract】

【中圖分類號】R446

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）09-0160-03

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.09.110

作者單位：遼寧省鞍山市腫瘤醫院檢驗科，遼寧 鞍山 114034