自噬通過抑制凋亡促進體外饑餓狀態下脂肪細胞存活*

李翅翅，　李力群，　黃春霞，　張　丹

(溫州醫科大學附屬第一醫院 1整形外科， 2呼吸與危重癥醫學科，浙江 溫州 325000)

?

自噬通過抑制凋亡促進體外饑餓狀態下脂肪細胞存活*

李翅翅1，李力群1，黃春霞1，張丹2△

(溫州醫科大學附屬第一醫院1整形外科，2呼吸與危重癥醫學科，浙江 溫州 325000)

[摘要]目的： 觀察體外饑餓狀態下脂肪細胞的自噬變化，研究自噬在維持體外饑餓狀態下脂肪細胞存活中的作用。方法: 將小鼠3T3-L1細胞誘導成為脂肪細胞后，雷帕霉素(rapamycin，RAP)預處理脂肪細胞，在缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)模擬的饑餓環境中孵育細胞。應用Western blotting及透射電鏡法檢測細胞自噬變化，用TUNEL染色及Western blotting檢測脂肪細胞凋亡。結果: OGD條件下脂肪細胞的自噬水平明顯升高，RAP預處理進一步上調了OGD條件下的細胞自噬。與對照組相比，OGD組細胞cleaved caspase-3的水平及細胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。RAP預處理降低了OGD 條件下cleaved caspase-3的水平，并明顯降低了細胞凋亡率(P<0.05)。結論: 自噬在饑餓狀態下脂肪細胞存活中發揮保護性作用，提高自噬水平有助于降低饑餓狀態下脂肪細胞的凋亡水平。

[關鍵詞]脂肪細胞； 饑餓； 自噬； 細胞凋亡； 雷帕霉素

自體脂肪細胞因具有來源豐富、獲取方便、無排異反應等優點，目前已被頜面外科和整形外科等廣泛應用于移植后填充面部皮下凹陷性缺損或畸形等。然而移植后脂肪細胞存活率較低導致該技術的治療效果不盡人意。研究表明，脂肪移植后在新的微環境中處于相對饑餓狀態，營養物質缺乏導致移植的細胞發生凋亡甚至壞死[1]。據報道，自體脂肪細胞移植后吸收率約25%～80%[2]。目前亟待尋求提高移植后脂肪細胞存活率或提高其對抗饑餓等應激刺激的方法。

自噬是真核細胞所特有的一種分解代謝過程，是細胞的一種保護性作用。生理狀態下細胞的自噬水平很低，但饑餓、缺血及缺氧等應激刺激可提高細胞自噬水平[3-4]。研究認為，自噬通過清除細胞內衰老細胞器及錯誤折疊蛋白，不僅抑制短期饑餓、缺血缺氧刺激條件下細胞死亡，并且可為細胞存活提供能量物質[5-6]。盡管如此，自噬是否對移植后脂肪細胞存活發揮作用目前尚不清楚。

雷帕霉素(rapamycin，RAP)是一種臨床上廣泛使用的免疫抑制劑，同時，RAP也是一種自噬促進劑，主要通過特異性抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體(mammalian target of rapamycin complex)1的功能而上調細胞自噬水平[7]。研究已發現RAP在多種疾病中發揮的細胞保護性作用源于其對自噬的調節[8-9]。本研究中，我們首先將3T3-L1細胞誘導成脂肪細胞，然后通過用RAP預處理的方法干預體外模擬饑餓狀態下脂肪細胞的自噬水平，由此研究自噬對饑餓狀態下脂肪細胞凋亡的調節作用。

材料和方法

1細胞及誘導分化

小鼠3T3-L1成纖維細胞(前脂肪細胞)購自ATCC。3T3-L1成纖維細胞使用正常高糖10%胎牛血清-11965 DMEM培養液培養，培養瓶置于37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱中。觀察到細胞融合后，加入誘導液A(1.67 μmol/L胰島素、1 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L IBMX)進行第1次誘導，并記為第0天。于第2天將誘導液A棄去，換以誘導液B(1.67 μmol/L胰島素)進行第2次誘導。隔天更換新鮮正常高糖10%胎牛血清-11965 DMEM培養液，在第8天可觀察到90%以上的細胞變圓并有大量脂滴出現，表明3T3-L1已被誘導成為成熟的脂肪細胞。收取細胞用于后續實驗。

2方法

2.1實驗分組及體外饑餓微環境模擬按照文獻[3]所描述的缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)方法在體外模擬饑餓微環境。將脂肪細胞隨機分為對照組和OGD組。對照組分為空白對照組和RAP處理組；OGD組分為單純OGD處理組及RAP預處理后進行OGD組。OGD模擬方法如下，將RAP按照10 nmol/L濃度加入細胞培養基中孵育4 h，然后用不含葡萄糖及胎牛血清的培養基更換正常培養基并將培養皿放入37 ℃無氧培養箱中孵育8 h。

2.2Western blotting用細胞蛋白裂解液處理脂肪細胞后收集細胞上清，然后行15% SDS-PAGE分離蛋白，使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置將凝膠中蛋白轉至PVDF膜上，設定轉膜電流為250 mA，轉膜時間為60 min，加入Western blot封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60 min，再分別以兔抗微管相關蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1-light chain 3, LC3)及兔抗活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3蛋白(cleaved caspase-3)單抗為Ⅰ抗，以標記有辣根過氧化物酶的羊抗兔Ig為Ⅱ抗孵育電轉膜。內參照蛋白選用β-actin。使用Thermo的ECL試劑為底物，曝光X光片，顯色、定影。最后通過Quantity One 4.6軟件對發光條帶的灰度值進行分析，通過比較各組LC3-II/LC3-I及cleaved caspase-3/β-actin的比值分別檢測自噬水平及活化caspase-3表達水平。

2.3透射電鏡標本制備及自噬結構斷面積統計在不同處理組的脂肪細胞中加入2.5%戊二醛，在4 ℃條件下預固定2 h。用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。然后用1%鋨酸固定3 h，再用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。50%→70%→90%乙醇逐級脫水，各15 min。在4 ℃條件下，用90%乙醇和90%丙酮混合液(1∶1)置換乙醇，再用90%丙酮置換，各15 min。然后，在室溫下用純丙酮置換3次，每次20 min。將細胞放入純丙酮和Jpurr樹脂(2∶1)的混合液中浸透，室溫條件下放置3 h。然后，在純丙酮和Jpurr樹脂(1∶2)的混合液中過夜。在37 ℃條件下，在Jpurr樹脂中放置2 h。依次于37 ℃烘箱中過夜，45 ℃烘箱中放置12 h，60 ℃烘箱中放置24 h。首先將包埋后的細胞塊于超薄切片機上切取厚度為1.5 mm的半薄切片，將其移到涂有蛋白甘油加水滴的載玻片上，然后于37 ℃烘箱內烘干。將甲苯胺藍染液(10 g/L)滴在切片上，5 min后，用洗瓶沖洗切片上多余的染液，濾紙吸干水分，自然干燥。光學顯微鏡下觀察半薄切片確定含有細胞，用Reichert-ultracut E型超薄切片機做超薄切片，厚度為50～60 nm。在透射電鏡下觀察細胞胞質內的自噬前體和自噬體等自噬相關結構。用VLCDS圖像分析儀檢測并分析單位細胞斷面面積內的自噬結構數目，比較OGD各組與對照組之間的差異。

2.4脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記 (TdT-mediated dUTP nick-end labeling, TUNEL)法檢測細胞凋亡按照上海碧云天生物技術有限公司生產的TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒說明書，將貼壁生長的脂肪細胞用冰冷PBS清洗2次,用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1次，用0.1%的Triton X-100于冰浴上孵育2 min，將配置好的TUNEL染色液50 μL加入后置于37 ℃培養箱內避光孵育1 h。然后在熒光顯微鏡下觀察并統計細胞凋亡率，綠色熒光細胞為TUNEL染色陽性的凋亡細胞。

3統計學處理

實驗均獨立重復3次，采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行處理，數據用均數±標準差(mean±SD)表示，各組間的差別采用單因素方差分析進行比較，各組均數間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1RAP預處理提高了OGD條件下脂肪細胞的自噬水平

與空白對照組細胞相比，RAP預處理增強了正常生長細胞LC3-I向LC3-II的轉化率(P<0.01)。OGD處理組細胞的LC3-II表達水平較對照組明顯增加(P<0.01)。與OGD處理組相比，RAP預處理增加了OGD條件下LC3-I向LC3-II的轉換(P<0.01)，見圖1。

2RAP預處理對OGD條件下脂肪細胞自噬超微結構的影響

本實驗中我們觀察到自噬前體呈馬蹄形樣雙層膜結構，其不完全包裹胞質樣物質，自噬體呈多層膜包裹的橢圓形結構，其包裹物為細胞胞質樣的物質。自噬溶酶體則為單層膜結構，其內容物為自噬體包裹物降解的碎片。統計分析表明，與對照組相比，RAP預處理后正常細胞組及OGD處理組細胞單位斷面面積內自噬相關超微結構的數目顯著增多(P<0.01)，而RAP預處理繼而OGD處理組細胞中此參數較單純OGD組進一步增高(P<0.01)，見圖2。

Figure 1.The autophagic level in oxygen-glucose deprivation (OGD)-challenged adipose cells with rapamycin (RAP) preconditioning. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsOGD group.

圖1Western blot方法檢測細胞自噬水平

Figure 2.Autophagic ultrastructures observed by transmission electron microscopy and statistical analysis. A: the autophagosome precursor (↑) was a hippocrepiform and had double membrane structure; B: the autophagosome was coated by multi-membrane (↑); the contents of the autophagosome may be cytoplasm; C: the autophagolysosome was a structure with single membrane and contained degraded cellular content (↑); D: quantitative analysis of the number of autophagosomes in different groups. Mean±SD.n=3.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsOGD group.

圖2自噬超微結構圖像及統計分析

3提高自噬水平改善了OGD引發的脂肪細胞凋亡

與對照組相比，RAP處理正常細胞組caspase-3表達無明顯變化，但OGD組細胞cleaved caspase-3水平明顯升高(P<0.01)。與單純OGD組相比，RAP預處理則顯著降低了OGD組細胞的cleaved caspase-3的水平(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects of autophagy on the protein levels of cleaved caspase-3 in OGD-challenged adipose cells.Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsOGD group.

圖3自噬對OGD條件下脂肪細胞凋亡基因caspase-3表達的影響

我們進一步用TUNEL染色法檢測細胞凋亡情況。與對照組細胞凋亡率相比，單純RAP預處理組細胞凋亡率改變不明顯，而OGD處理后細胞凋亡率明顯上升(P<0.01)。與單純OGD組相比，RAP預處理后OGD處理組細胞凋亡率下降(P<0.05)，見圖4。

討論

本實驗檢測了OGD條件下脂肪細胞的自噬變化并研究了自噬對OGD微環境下脂肪細胞凋亡及存活的影響。與對照組相比，OGD條件下脂肪細胞的自噬水平升高，cleaved caspase-3的蛋白水平上調，細胞凋亡率明顯升高。預先用RAP提高自噬水平后，明顯降低了OGD誘發的細胞凋亡率。本文提出，適度提高自噬有利于降低OGD條件下脂肪細胞的凋亡，從而促進細胞存活。

游離脂肪組織移植后致高吸收率和低存活率問題的主要原因是脂肪細胞對缺糖缺氧環境的耐受力差，在重新建立血運之前脂肪細胞處于饑餓狀態，最終導致細胞凋亡、壞死發生[1]。我們的研究也進一步驗證了這個過程。OGD方法體外模擬饑餓環境中，脂肪細胞的活化caspase-3水平及凋亡率較對照組明顯升高。同樣，OGD環境下細胞自噬水平較對照組明顯上調。為了進一步明確自噬與凋亡之間的相互作用關系，我們用RAP預處理提高細胞自噬水平。我們發現自噬水平提高的脂肪細胞在OGD條件下，活化的caspase-3蛋白水平及凋亡率均較單純OGD條件下細胞降低。這表明，自噬對細胞凋亡發生抑制作用。既往研究表明，活化的caspase-3是凋亡級聯反應的最初激活激酶。我們推斷，caspase-3很可能是OGD條件下自噬發揮其凋亡抑制作用的主要調節靶點之一。除此之外，自噬可能通過其它作用發揮凋亡抑制作用。研究表明，細胞通過自噬包裹受損的線粒體，由此減少了損傷線粒體內諸如細胞色素C等一系列促凋亡因子的釋放，從而抑制了凋亡的啟動[10]。這些過程對于移植后脂肪細胞在建立新的血液循環前饑餓環境下的存活是有益的。

Figure 4.The effect of autophagy on the apoptotic rate of adipose cells challenged by OGD (TUNEL assay). Promoting autophagy with RAP alleviated OGD-induced apoptosis of the adipose cells. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsOGD group.

圖4自噬對OGD條件下脂肪細胞凋亡率的影響

RAP因具有抑制炎癥反應的作用而最初主要用于抑制臨床上器官移植后的免疫排斥。近年來，研究證實RAP可以通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性而誘導自噬水平[7]。我們在本研究中發現，RAP預處理可以有效上調OGD條件下脂肪細胞的自噬水平，并明顯降低了細胞凋亡率。在饑餓、缺血缺氧等應激狀態下，細胞內無菌性炎癥反應的發生是致細胞凋亡、壞死的主要原因之一。我們在之前研究中發現，低劑量RAP可以有效誘導體外模擬缺血再灌注微環境中肺微血管內皮細胞自噬，并減輕細胞死亡及損傷，此作用絕大部分源于其對細胞自噬的誘導作用[11]。其它研究也證實，RAP的作用呈劑量依賴性，低劑量RAP發揮的免疫抑制作用微乎其微，高劑量則發揮明顯抗炎作用，甚至易導致細胞轉化為腫瘤細胞[12]。本研究中使用的藥物劑量遠低于其免疫抑制或致瘤性所需劑量。所以，將低劑量RAP用于臨床脂肪細胞移植治療具有可行性，可同時發揮其抗炎及促自噬的雙重作用而促進細胞存活，并且避免了高劑量可能致腫瘤形成等不良作用。

綜上所述，本研究明確了低劑量RAP預處理可有效提高脂肪細胞的自噬水平。而提高自噬水平可通過抑制活化凋亡相關蛋白酶caspase-3的活化而降低了OGD模擬的饑餓狀態下細胞凋亡，從而提高脂肪細胞在體外饑餓條件下的存活。我們的研究為進一步闡明移植后脂肪細胞存活、死亡機制提供了新的實驗依據，并且本研究結果表明低劑量RAP干預自噬有望作為未來改善脂肪細胞移植治療效果的新手段。

[參考文獻]

[1]Nishimura T, Hashimoto H, Nakanishi I, et al. Microvascular angiogenesis and apoptosis in the survival of free fat grafts [J]. Laryngoscope, 2000, 110(8):1333-1338.

[2]K?lle SF, Fischer-Nielsen A, Mathiasen AB, et al. Enrichment of autologous fat grafts with ex-vivo expanded adipose tissue-derived stem cells for graft survival: a rando-mised placebo-controlled trial[J]. Lancet, 2013, 382(9898):1113-1120.

[3]張丹，李靜，李玉蘋，等. 自噬減輕模擬缺血/再灌注微環境中肺微血管內皮細胞損傷[J]. 中國病理生理雜志，2015, 31(7):1253-1258.

[4]胡鵬飛，賴東武，何紅. 自噬在晚期糖基化終產物誘導的內皮細胞凋亡的作用[J]. 中國病理生理雜志，2012, 28(6):1006-1011.

[5]Yabu T, Imamura S, Mizusawa N, et al. Induction of autophagy by amino acid starvation in fish cells[J]. Mar Biotechnol (NY), 2012, 14(4):491-501.

[6]Loos B, Genade S, Ellis B, et al. At the core of survival: autophagy delays the onset of both apoptotic and necrotic cell death in a model of ischemic cell injury[J]. Exp Cell Res, 2011, 317(10):1437-1453.

[7]Kim YC, Guan KL. mTOR: a pharmacologic target for autophagy regulation[J]. J Clin Invest, 2015, 125(1):25-32.

[8]Sekiguchi A, Kanno H, Ozawa H, et al. Rapamycin promotes autophagy and reduces neural tissue damage and locomotor impairment after spinal cord injury in mice[J]. J Neurotrauma, 2012, 29(5):946-956.

[9]楊鳳杰，周建華，呂倩影, 等. 雷帕霉素減緩大鼠被動Heymann 腎炎的進展 [J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(9):1661-1665.

[10]Kim I, Lemasters JJ. Mitochondrial degradation by autophagy (mitophagy) in GFP-LC3 transgenic hepatocytes during nutrient deprivation [J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2011, 300(2):C308-C317.

[11]Zhang D, Li C, Zhou J, et al. Autophagy protects against ischemia/reperfusion-induced lung injury through alleviating blood-air barrier damage[J]. J Heart Lung Transplant, 2015, 34(5):746-755.

[12]Cicora F, Lausada N, Vasquez DN, et al. Sirolimus in kidney transplant donors and clinical and histologic improvement in recipients: rat model[J]. Transplant Proc, 2010, 42(1): 365-370.

(責任編輯： 林白霜， 羅森)

*[基金項目]寧波市社會發展計劃(No. 2011C50021)

▲并列第1作者

Autophagy promotes survival of adipose cells by inhibiting apoptosis underinvitrostarvation LI Chi-chi1, LI Li-qun1, HUANG Chun-xia1, ZHANG Dan2

(1DepartmentofPlasticSurgery,2DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000，China.E-mail:zhangdan6250@yeah.net)

[ABSTRACT]AIM: To detect the changes of autophagy in adipose cells under starvation, and to clarify the effects of autophagy on the cell survival and apoptosis under starvation. METHODS: Rapamycin (RAP) was applied to promote autophagy of adipose cells. These cells were then incubated under oxygen-glucose deprivation (OGD) condition. After exposure of the cells to OGD, the changes of autophagy and apoptosis were determined by Western blotting, transmission electron microscopy and TUNEL assay. RESULTS: Compared with the control cells, OGD-challenged cells had much higher level of autophagy. The apoptotic rate in OGD group was much higher than that in control group, which was reflected by increased protein level of activated caspase-3 and percentages of TUNEL positive cells. Preconditioning with RAP effectively improved OGD-induced autophagy, but did not affect the cell survival and apoptosis under normal condition, and obviously decreased the apoptotic rate of the cells under OGD condition. CONCLUSION: Autophagy protects adipose cells against starvation-induced apoptosis. Promotion of autophagy is helpful for attenuating starvation-induced apoptosis of the cells under OGD condition.

[KEY WORDS]Adipose cells; Starvation; Autophagy; Apoptosis; Rapamycin

通訊作者△Tel: 0574-87035808； E-mail: yexiaolei@gmail.com

[收稿日期]2015- 04- 13[修回日期] 2015- 09- 20

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2233- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.019

[中圖分類號]R622; R363

[文獻標志碼]A