體外誘導人腎間質成纖維細胞成骨分化*

嚴一杰，　黎承楊△，　鄧耀良，　曾國華，　陶芝偉，　劉云龍，　孫　春，　王　揚

(1廣西醫科大學第一附屬醫院泌尿外科，廣西 南寧 530021； 2廣州醫科大學第一附屬醫院泌尿外科，廣東 廣州 510120)

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體外誘導人腎間質成纖維細胞成骨分化*

嚴一杰1，黎承楊1△，鄧耀良1，曾國華2，陶芝偉1，劉云龍1，孫春1，王揚1

(1廣西醫科大學第一附屬醫院泌尿外科，廣西 南寧 530021；2廣州醫科大學第一附屬醫院泌尿外科，廣東 廣州 510120)

[摘要]目的： 觀察在體外培養條件下，使用成骨誘導培養液或不同濃度鈣離子誘導人腎間質成纖維細胞發生成骨分化的效果，初步探討腎臟Randall斑形成可能的細胞機制。方法: 體外培養人腎間質成纖維細胞，實驗分為5組：成骨誘導組(加成骨誘導液)、CaⅠ組(加0.5 mmol/L Ca2+液)、CaⅡ組(加1.5 mmol/L Ca2+液)、Ca Ⅲ 組(加2.5 mmol/L Ca2+液)和對照組(加PBS)。各組細胞分別培養至第1、3、6、9天時，采用MTT法檢測細胞活力；誘導至第9天時，用細胞鈣茜素紅染色液和鈣鈷法磷酸酶染色液對各組細胞進行染色，觀察鈣結節形成和堿性磷酸酶的表達情況。另外，分別采用real-time PCR和Western blot檢測各組細胞不同時間點Runt相關轉錄因子2(Runx2)的 mRNA和蛋白表達水平。 結果: 在1.5 mmol/L 和2.5 mmol/L Ca2+濃度條件下細胞的活力明顯受抑制。細胞染色結果證實成骨誘導液組和鈣離子組均可以見到典型的紅色鈣結節和黑色塊狀的硫化鈷沉淀物。成骨誘導組細胞Runx2的mRNA和蛋白相對表達量(0～9 d)逐漸升高(P<0.05)；誘導至第9天時，3個鈣離子組細胞Runx2的mRNA和蛋白表達呈濃度依賴性升高(P<0.05)。結論: 在體外培養環境下，人腎成纖維細胞可以在成骨誘導培養液的刺激作用下發生成骨分化；另外，在高鈣離子環境，人腎成纖維細胞也發生了類似的成骨分化。腎乳頭組織中的成纖維細胞在高鈣離子等因素的作用下發生成骨分化，這可能是腎臟Randall斑形成的細胞學基礎。

[關鍵詞]人腎成纖維細胞； 成骨分化； 腎乳頭鈣化斑； 高鈣尿癥； 腎結石

腎結石的起源問題是當前結石研究的重要問題。根據臨床病例觀察和腎臟標本病理分析的研究結果，腎乳頭鈣化斑塊Randall斑的形成被認為是結石形成最可能的起點，在誘導結石晶體異質成核并最終形成結石的過程中起重要的作用[1-3]。Randall斑形成的機制目前尚未明確，高鈣尿、尿液的酸化和水的濃縮都被推斷在Randall斑的形成中發揮作用，其中，高鈣尿的作用特別值得關注[4-5]。另外，有研究發現，腎間質組織鈣化形成可能與腎組織細胞成分發生成骨分化有關[1, 6-8]。我們推測，作為腎間質主要細胞成分之一的成纖維細胞可能存在成骨分化的潛能，并在高鈣離子等病理因素的作用下發生成骨分化，這可能是腎間質組織Randall斑形成的細胞基礎。本研究建立體外細胞培養體系，使用成骨誘導培養基或不同濃度的鈣離子誘導人腎間質成纖維細胞，觀察成骨分化的效果。

材料和方法

1主要材料

人腎成纖維細胞(上海齊陰生物科技有限公司)；細胞茜素紅鈣染色試劑盒和堿性磷酸酶染色液試劑盒(Jason)； I 抗Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2, Runx2) 抗體( Sigma)；逆轉錄試劑盒和real-time PCR 相關試劑、人Runx2、β-actin引物(TaKaRa)。

2成骨誘導液和含鈣離子培養液的配制

傳統成骨誘導液[9]包含DMEM/F12、10% 胎牛血清、1%雙抗、1% β甘油酸磷酸鈉、0.1%地塞米松、0.5%維生素 C。

高鈣離子培養液：取二水氯化鈣(CaCl2·2H2O)粉劑用生理鹽水分別稀釋為5、15、25 mmol/L，高壓滅菌后于-20 ℃保存。使用時，用DMEM/F12稀釋10倍。

3實驗分組

實驗分為5個組：① 成骨誘導組(加成骨誘導液)； ② CaⅠ組(加0.5 mmol/L Ca2+液)；③ CaⅡ組(加1.5 mmol/L Ca2+液)；④ Ca Ⅲ 組(加2.5 mmol/L Ca2+液)；⑤ 對照組(加PBS)。各組細胞分別培養至第1、3、6、9天時，采用MTT法檢測細胞活力。誘導至第9天時，用細胞鈣茜素紅染色液和鈣鈷法磷酸酶染色液對各組細胞進行染色，觀察鈣結節形成和堿性磷酸酶的表達情況。另外，成骨誘導組在成骨誘導的第0、3、6和9天，3個鈣離子組在成骨誘導的第9天時，分別采用real-time PCR和Western blot檢測各組細胞Runx2的mRNA和蛋白表達水平。

4實驗方法

4.1MTT實驗檢測各組的細胞活力取生長良好的第 4 代的人腎成纖維細胞，以 2×107/L 的密度接種于 96 孔板，細胞融合后，按分組情況更換含 10% 胎牛血清 的不同誘導培養基。每組設 10 個孔，每 2 d換液，在第1、3、6、9、10天分別取出各組相應孔板，每孔加入 20 μL 的 MTT 溶液，37 ℃孵育 4 h 后，棄上清液，每孔加入 150 μL DMSO，混勻。用酶聯免疫檢測儀于 490 nm 波長下，測定吸光度(A)值。以時間為橫軸，以A值為縱軸繪制細胞生長曲線。

4.2細胞鈣茜素紅染色對誘導至第9天的成骨誘導組、CaⅠ～Ⅲ組和對照組行細胞茜素紅鈣染色，染色過程按說明書進行。茜素紅和鈣離子以鰲和方式形成復合物，用以識別組織細胞的鈣鹽成分。鈣鹽變化是骨細胞增殖分化和骨組織成骨潛能的標志之一。通過茜紅素染色，有鈣鹽成份則產生桔紅色沉積。

4.3堿性磷酸酶Gomori改良鈣鈷法染色CaⅠ～Ⅲ誘導組和對照組培養至第9天時，行堿性磷酸酶Gomori改良鈣鈷法染色：取出細胞爬片，PBS緩沖液沖洗2次后冰乙醇固定10 min，雙蒸水沖洗3次。于孵育底液中37 °C孵育5 h后，蒸餾水沖洗1 min。2%硝酸鈷中浸5 min后，蒸餾水沖洗3次。1%的硫化銨浸洗1 min ，自來水沖洗，自然干燥，封固。倒置顯微鏡下觀察拍照，酶所在陽性部位為黑色硫化鈷沉淀。

4.4Real-time PCR檢測各組細胞Runx2 mRNA的表達水平單層培養細胞，直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，按總RNA提取試劑盒操作說明步驟提取總RNA，紫外分光光度儀測定RNA的濃度。反轉錄cDNA合成采用20 μL體系(含待測RNA 1.0 μg，oligo dT Primer 1 μL，Random 6 Primers 1 μL，PrimeScriptTMRT enzyme Mix I 1 μL，5×PrimeScriptTMbuffer 4 μL)，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。SYBR Green 染料法進行PCR定量檢測。采用20 μL體系[含待測cDNA 1 μL，上、下游引物各0.6 μL(10 μmol/L)，2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，dH2O 7.8 μL]，95 ℃ 10 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s 共40個循環擴增反應。引物由TaKaRa合成：Runx2的上游引物為5’-ATGTGTGTTTGTGTAGCAGCA-3’， 下游引物為5’-TCCCTAAAGTCTCTCGGTATGTGTA-3’，產物大小為199 bp； β-actin的上游引物為5’-CATGTACGTAGCTATCCAGGC-3’，下游引物為5’-CTCCTTAATGTGACGCACGAT-3’，產物大小為250 bp。采用2-ΔΔCt法求得目的基因的相對表達量，2-ΔΔCt代表實驗組目的基因相對于對照組的變化倍數。ΔΔCt=實驗組(目的基因Ct值-管家基因Ct值)-對照組(目的基因Ct值-管家基因Ct值)。

4.5Western blot法檢測各組細胞Runx2蛋白的表達水平向培養皿中加入裂解液，用勺子刮下細胞，加RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白質濃度，每孔取50 μg上樣，在12%的SDS凝膠中進行電泳分離，電轉移法將蛋白質轉移至PVDF膜上，在含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉60 min，加入Runx2 I抗或GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜，1×TBST充分漂洗(10 min 3次)，加入辣根過氧化物酶標記的IgG，室溫60 min，1×TTBS充分漂洗(10 min 3次)，ECL法顯色，陽性條帶以Gelpro4 凝膠光密度分析軟件進行分析，測其光密度(IA)值，結果以目的蛋白IA/GAPDHIA作相對定量值進行比較。

5統計學處理

使用SPSS 11.0軟件包完成統計分析。數據均以均數±標準差(mean±SD)表示。正態資料均數比較用方差分析，組間差異做組間兩兩比較時，方差齊用SNK法，方差不齊用Games-Howell法。非正態性資料用秩和檢驗Kruskal-Wallis分析。當存在組間差異時，行變量轉換后，再用SNK法行兩兩比較。相關性用Spearman秩相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1MTT結果

與對照組相比較，CaⅡ和Ca Ⅲ誘導組在第1、3、6、9天細胞活力均受抑制，差異均有統計學意義(P<0.05)；成骨誘導組細胞活力在第1、3、6、9天分別與對照組相比較，差異均無統計學意義。CaⅠ組僅在第9天時，細胞生長較對照組受到抑制(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol.

圖1MTT法檢測各組細胞不同時點細胞存活率

2細胞鈣茜素紅染色結果

成骨誘導第9天實驗組細胞鈣茜素紅染色出現鈣結節陽性，而對照組為鈣結節染色陰性，見圖2。3個鈣離子組誘導至第9天時細胞鈣茜素紅染色結果顯示鈣離子誘導成纖維細胞組隨著鈣離子濃度增加，細胞鈣茜素紅染色鈣結節的數量、密度逐漸增加，且染色逐漸變深，見圖3。

Figure 2.The cell Alizarin red S staining of human renal fibroblasts in the osteogenic induction group (×200).

圖2成骨誘導組細胞鈣茜素紅染色結果

Figure 3.The cell Alizarin red S staining of human renal fibroblasts in the three calcium groups (×200).

圖33個鈣離子組細胞鈣茜素紅染色結果

3堿性磷酸酶染色結果

3個鈣離子組誘導至第9天時對成纖維細胞行堿性磷酸酶染色，鈣離子誘導各組均出現黑色沉淀，且黑色沉淀的數量、密度隨著鈣離子濃度的增加而增加。對照組未見黑色沉定，見圖4。

Figure 4.The cell alkaline phosphatase staining of human renal fibroblasts in the three calcium groups (×200).

圖43個鈣離子組細胞堿性磷酸酶染色結果

4各誘導組細胞Runx2 mRNA的表達水平

成骨誘導組不同誘導時點與正常對照組比較，Runx2 mRNA的表達水平均增高(P<0.05)。成骨誘導組培養第3、6、9天組Runx2 mRNA的表達水平分別是對照組的1.52倍、2.23倍和3.07倍，見圖5。

Figure 5.The mRNA expression of Runx2 in the human renal fibroblast cells in osteogenic induction groups. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 d.

圖5成骨誘導組細胞Runx2 mRNA的表達情況

CaⅠ、CaⅡ、CaⅢ誘導第9天組細胞Runx2 mRNA的表達水平與對照組比較均升高(P<0.05)。CaⅠ組、CaⅡ組、CaⅢ組分別是對照組的1.68倍、2.87倍和3.92倍。正常培養液組各時點細胞Runx2 mRNA的表達水平差異無統計學意義，見圖6。

Figure 6.The mRNA expression of Runx2 in the human renal fibroblasts in control and CaⅠ～Ⅲ groups (all induced for 9 days). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol.

圖63個鈣離子組細胞Runx2 mRNA的表達情況

5各誘導組細胞Runx2蛋白的表達水平

Western blot 檢測發現，與正常對照組(0 d)比較，成骨誘導組不同誘導時點(3、6、9 d)細胞Runx2的蛋白相對表達水平均增高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

Figure 7.The protein expression of Runx2 in the human renal fibroblasts in osteogenic induction groups. Mean±SD.n=4.*P<0.05vs0 d.

圖7成骨誘導組細胞Runx2蛋白的表達情況

誘導至第9天時， CaⅠ、CaⅡ、CaⅢ 各組細胞Runx2 蛋白表達量較對照組均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。同時，各組間差異有統計學意義(P<0.05)，見圖8。

Figure 8.The protein expression of Runx2 in human renal fibroblasts in control and CaⅠ～Ⅲ groups (all induced for 9 days ). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol.

圖83個鈣離子組細胞Runx2 蛋白的表達情況

討論

Randall斑是腎乳頭部位的鈣化斑塊，為腎乳頭表面與上皮下斑塊相關的損傷部位，出現在74%的結石患者和43%的結石無關疾病的患者中，其中，含鈣結石出現的比率最高(草酸鈣88%，磷酸鈣100%)[10]。Evan等[11]認為Randall斑是草酸鈣結石形成的起始點，草酸鈣成核并附著于Randall斑上，進一步發展形成結石。臨床研究發現，Randall斑覆蓋的面積與高鈣尿和結石的數量呈正相關[12-13]。因此，Randall斑與高鈣尿和結石形成關系密切，值得深入研究。

已經發現高鈣尿可導致細胞損傷和炎癥反應[14-15]，但有學者對腎臟內Randall斑進行組織活檢研究，發現Randall斑組織及其周圍組織無明顯的細胞損傷和炎癥反應[5]。這提示我們Randall斑的形成與細胞損傷和炎癥反應無關，可能另有其它不同的機制。根據最近的研究發現[6]，在特發性高鈣尿模型大鼠腎組織中，與組織鈣化相關的蛋白如骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP2)、Runx2、鋅指結構轉錄因子(osterix，OSX)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)較正常組表達顯著升高。隨后又有臨床研究證實，特發性高鈣尿癥患者腎乳頭組織異常表達Runx2、Osterix、BMP2、MSX2，研究結果提示高鈣尿癥患者腎間質的鈣化可能和正常骨形成的生理機制相似[7-8]。這些研究發現提示高鈣尿可能通過刺激腎組織發生成骨分化而誘導了Randall斑的形成。

已經發現生物體內異位組織成骨作用似乎普遍存在。例如，近年來發現，血管的鈣化是一種類似于骨質礦化主動且可以調控的過程，該過程表達骨形成相關蛋白如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、OPN、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)等[16]。Mohler等[17]發現，提取鈣化的主動脈瓣膜間質組織細胞于體外培養的條件下可以向成骨細胞轉分化，該特征與血管平滑肌細胞一致，均可形成鈣結節。這提示主動脈瓣鈣化的細胞學基礎可能為瓣膜間質細胞向成骨細胞表型轉化。腎乳頭部位鈣化斑塊的形成也可能是腎組織發生成骨分化的過程。眾所周知，腎乳頭間質鈣鹽沉積成分羥基磷灰石本質上類似正常骨組織的鈣鹽成分。目前有關腎乳頭成骨分化的研究仍缺乏，腎組織中哪些細胞參與了成骨分化仍需要深入研究。

成纖維細胞同成骨細胞一樣來源于中胚葉的間充質細胞，從細胞的來源來說，兩者有著相同的來源，并與成骨細胞一樣具備新骨形成所必需的所有條件，成纖維細胞能夠提供基質鈣化所必需的 Ca2+，合成、分泌可鈣化的膠原纖絲Ⅰ、Ⅱ型，分泌形成可鈣化的基質小泡[18]。研究發現，某些組織源成纖維細胞(如嚙齒動物和人皮膚成纖維細胞和支氣管壁成纖維細胞)具有間充質干細胞表面抗原免疫表型，展現出成脂、成骨、成軟骨等多向分化潛能[19-20]。國內有人總結表明人體多種組織源成纖維細胞在體內外特殊環境下均能向成骨細胞轉分化[21]。但是，腎組織源成纖維細胞是否存在成骨分化的潛能，目前國內外鮮有報道。根據以上研究結果，我們推測：腎乳頭組織內的成纖維細胞可能具有成骨分化的潛能，在特定條件下(如高鈣尿環境)，其可向成骨細胞轉分化，導致Randall斑的形成，這可能是Randall斑形成重要機制，對此，國內外尚缺乏相關研究。

本研究發現，腎間質成纖維細胞在含有地塞米松等成分的傳統成骨誘導培養基的刺激作用下，展現出成骨分化潛能。成骨誘導至第9天時樣本細胞染色呈現典型陽性，而對照組染色陰性，這提示人腎成纖維細胞存在成骨分化能力。此外，根據real-time PCR和Western blot結果，我們發現隨著成骨誘導培養基培養時間的延長，Runx2的表達水平逐漸升高。Runx2是細胞發生成骨分化的早期最具特異性的標志物，它可以調控成骨前體細胞分化為成熟成骨細胞，并啟動下游成骨標志性蛋白諸如OCN、OPN、Ⅰ型膠原等的表達，被認為是成骨發生的關鍵因子，為成骨分化和成熟所必需[22-23]。因此，本研究結果提示腎間質成纖維細胞在成骨培養液的誘導下發生了成骨分化，人腎成纖維細胞具備成骨分化的潛能。

高鈣尿是否具有誘導人腎成纖維細胞發生成骨分化作用是本研究主要關注的問題。研究發現，在高鈣離子環境下，樣本細胞出現典型的鈣結節, 類似于成骨誘導培養基的刺激作用結果。誘導至第9天時，3個鈣離子組與對照組相比其細胞表達Runx2的mRNA和蛋白呈濃度依賴性升高，細胞Runx2蛋白的表達水平與mRNA表達的趨勢基本一致。另外本研究發現，誘導至第9天時3個鈣離子組樣本明顯表達堿性磷酸酶，而對照組則為陰性。因此可以認為，高鈣離子誘導人腎成纖維細胞發生了成骨分化。由于Runx2只是細胞成骨分化的早期標記物，為了確定成骨分化的最終形成，需要進一步的研究，包括分析有關成骨分化過程中的各種信號通路以及檢測成骨分化晚期的特異標志性蛋白如OCN和OPN等。

歸納起來，本研究結果提示，在體外培養環境下，人腎成纖維細胞可以在成骨誘導培養液的刺激作用下發生成骨分化；另外，在高鈣離子環境，人腎成纖維細胞也發生了類似的成骨分化。腎乳頭組織中的成纖維細胞在高鈣離子等因素的作用下發生成骨分化，這可能是腎臟Randall斑形成的細胞學基礎。

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(責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)

*[基金項目]浙江省自然科學基金資助項目(No. LY13H060003)；浙江省中醫藥科學研究基金計劃(No. 2012ZB161)

Induction of osteogenic differentiation of human renal fibroblastsinvitroYAN Yi-jie1, LI Cheng-yang1, DENG Yao-liang1, ZENG Guo-hua2, TAO Zhi-wei1, LIU Yun-long1, SUN Chun1, WANG Yang1

(1DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2DepartmentofUrology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:assheep@163.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the effects of osteogenic induction media and the medias containing different concentration of calcium on the induction of osteogenic differentiation of human renal fibroblasts in vitro. METHODS: Cultured human renal fibroblasts were divided into 5 groups in this experiment: osteogenic induction group (osteogenic induction media), CaⅠgroup (0.5 mmol/L Ca2+media), CaⅡgroup (1.5 mmol/L Ca2+media), Ca Ⅲ group (2.5 mmol/L Ca2+media) and control group (PBS). The cell activity in each groups was measured by MTT assay. At 9th day, the cell calcium Alizarin red S staining and alkaline phosphatase (ALP) Gomori calcium cobalt staining were performed respectively to observe the formation of calcium nidus and the expression of ALP. In addition, the expression of Runt-related transcription factor 2 (Runx2) at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot， respectively. RESULTS: The remarkable positive signs which represented the formation of calcium nidus and the deposit of calcium objects in all experiment groups were observed. The mRNA and protein expression of Runx2 in osteogenic induction group increased in accordance with the induction time. Compared with control group, the mRNA and protein expression of Runx2 in the CaⅠ～Ⅲ groups increased gradually in a calcium concentration dependent manner at the 9th induction day. CONCLUSION: Human renal interstitial fibroblasts show the potential activity in osteogenic differentiation induced by osteogenic induction media or high level calcium in vitro, which may be account for the cytological formation of the Randall’s plaque in the kidney.

[KEY WORDS]Human renal interstitial fibroblasts; Osteogenic differentiation; Randall’s plaque; Hypercalciuria; Renal calculi

通訊作者△Tel: 0575-88345836; E-mail: zhangyunbme@126.com

[收稿日期]2015- 05- 19[修回日期] 2015- 08- 31

[文章編號]1000- 4718(2015)12- 2265- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.025

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A