白花丹醌對人肝星狀細胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影響*

楊成芳，　李　麗，　李勇文，　鐘毓娟，　熊美麗，　方舒萍

(桂林醫學院，廣西 桂林 541004)

?

白花丹醌對人肝星狀細胞Nox4/ROS及α-SMA生成的影響*

楊成芳，李麗△，李勇文，鐘毓娟，熊美麗，方舒萍

(桂林醫學院，廣西 桂林 541004)

[摘要]目的： 研究白花丹醌(plumbagin)對轉化生長因子β1(TGF-β1)刺激的體外培養人肝星狀細胞(HSC-LX2)NADPH氧化酶4(Nox4 )的mRNA和蛋白表達、活性氧簇(ROS)水平及α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白表達的影響。方法: 體外培養HSC-LX2，隨機設立空白組、TGF-β1刺激的模型組、TGF-β1+ plumbagin (2 μmol/L、1.5 μmol/L及1 μmol/L)組；細胞與各藥物共同孵育72 h后，采用RT-PCR檢測細胞Nox4 mRNA的表達；原位裝載探針法測定細胞內ROS的水平；Western blot檢測細胞內Nox4和α-SMA的蛋白含量。結果: 與模型組比較，白花丹醌作用72 h后，2 μmol/L和1.5 μmol/L plumbagin能明顯降低HSC-LX2細胞Nox4 mRNA和蛋白的表達(P<0.01)，下調ROS水平，降低α-SMA的蛋白表達(P<0.01)。結論: Plumbagin可能是通過下調Nox4的表達進而降低ROS生成從而發揮其抑制HSC-LX2細胞活化的作用。

[關鍵詞]白花丹醌； 轉化生長因子β1； HSC-LX2細胞； NADPH氧化酶4； 活性氧簇； α-平滑肌肌動蛋白

研究顯示氧化應激可以誘導人肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化，其中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)與HSCs的活化密切相關，其活化后高表達的α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)具有調節、分泌細胞因子和基質金屬蛋白酶并產生大量的細胞外基質，這些是肝纖維化的細胞學基礎[1-2]。NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)、一氧化氮合酶、環氧合酶、細胞色素P450氧化酶和黃嘌呤氧化酶等所催化的反應過程中均伴有ROS的產生[3]。 Nox至少有7種亞型，在肝臟中Nox4是介導ROS產生的最主要的Nox亞型，在肝細胞、肝星狀細胞和肌纖維母細胞內Nox4的表達遠遠高于其它亞型[4-5]。由Nox4產生的ROS可介導絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路激活，促進HSCs的激活并抑制其凋亡，最終導致肝纖維化的形成[4,6-7]。本課題組前期研究發現白花丹醌能抑制HSC的增殖與活化，國內也有相關的研究，但其通過抗氧化應激作用抑制HSC-LX2細胞株的增殖與活化尚未有文獻報道。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是作用最強的促肝纖維化因子[8-9]。本研究擬用TGF-β1刺激HSC-LX2細胞建立活化的HSC-LX2細胞模型，旨在探討白花丹醌抑制HSC-LX2細胞活化的分子機制。

材料和方法

1實驗材料

1.1細胞來源人肝星狀細胞株HSC-LX2(博慧斯生物醫藥科技有限公司)。

1.2藥物與試劑白花丹醌、維生素E(vitamin E，Vit E)和LY364947(TGF-β1受體抑制劑)均購自Sigma；高糖DMEM培養基和胎牛血清(HyClone)；TGF-β1、novoprotein、RNApure高純總RNA快速提取試劑盒和2×Taq PCR Master Mix(北京艾德萊生物)；TIANScript cDNA 第1鏈合成試劑盒(TIANGEN)；兔抗人Nox4單克隆抗體(上海生工)；鼠抗人GAPDH/α-SMA單克隆抗體(Aidlab Biotechnologies)； HRP 標記山羊抗兔/兔抗鼠 II 抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)； ROS探針(Cayman)。

1.3主要儀器CO2培養箱(Thermo)；高速冷凍離心機(Eppendorf)；PTC-220多通道PCR儀(MJ)；核酸蛋白測定儀(Shimadzu)；倒置相差顯微鏡(Zeiss)；DYY-6D凝膠電泳儀/電泳槽(北京賽因坦科技有限公司)；JS-780全自動凝膠成像分析系統(上海培清科技)；蛋白電泳儀/電轉膜儀(JY600C,上海生工)。

2實驗方法

2.1細胞培養將人肝星狀細胞系HSC-LX2置于10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養液，37 ℃、5% CO2條件下培養，隔天換液，待細胞長至70%～80%密度時用0.25%的EDTA胰蛋白酶消化，每2～3 d傳代1次，每次實驗均取呈指數生長的細胞進行。

2.2MTT法檢測白花丹醌對TGF-β1+LY364947作用后HSC-LX2細胞活力的影響MTT操作步驟參照文獻[10]進行。對照組加入含終濃度為5 μg/L 的TGF-β1+終濃度為1 μmol/L的LY364947，各給藥組在對照組的基礎上加入含各濃度的藥物作用72 h，各組白花丹醌終濃度分別為0.25、0.5、1、2、4、8、16和32 μmol/L，每組設6個復孔。計算細胞活力抑制率。細胞活力抑制率=(A對照組-A給藥組)/A對照組×100%。

2.3RT-PCR和Western blot實驗的細胞分組及處理空白對照組：加入胎牛血清的DMEM高糖培養液；模型組：加入含TGF-β1終濃度為5 μg/L胎牛血清DMEM高糖培養液；白花丹醌高、中、低濃度組：在加入終濃度為5 μg/L TGF-β1刺激24 h基礎上加入白花丹醌作用72 h，終濃度分別為2 μmol/L、1.5 μmol/L和1 μmol/L[11]。

2.4RT-PCR檢測HSC-LX2細胞 Nox4的mRNA表達采用TRIzol法抽提細胞中總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量和純度，A260/A280均在1.8～2.0之間；取總RNA 5 μg，采用M-MuLV 逆轉錄酶將其逆轉錄成cDNA；用Primer Premier 5.0自行設計引物，Nox4的上游引物序列為5’-CCGAACACTCTTGGCTTACC-3’，下游引物序列為5’-CACTGAGAAGTTGAGGGCATT-3’；β-actin的上游引物序列為5’-CACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’，下游引物序列為5’-CGTACAGGTCTTTGCGGATGTC-3’。所得cDNA按2×Taq PCR Master Mix試劑盒說明，加2 μL cDNA模板擴增基因片段，PCR反應參數為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環；72 ℃ 5 min。反應結束后取10 μL RT-PCR產物及8 μL DNA marker進行2%瓊脂糖凝膠電泳，結果經培清JS-780全自動凝膠成像分析系統進行分析，樣本Nox4的mRNA PCR產物條帶的光密度與內參照β-actin的mRNA PCR產物條帶的光密度(A)比值作半定量分析。實驗重復3次。

2.5原位裝載探針法檢測HSC-LX2細胞內ROS的生成將呈指數生長的HSC-LX2細胞以每孔5×103的密度接種于6孔板，分為空白對照組、TGF-β1模型組、Vit E(200 mg/L)組[12]以及白花丹醌2 μmol/L、1.5 μmol/L和1 μmol/L組。藥物與細胞共孵育72 h后，棄培養基，除正常組外，各組加含TGF-β1終濃度為5 μg/L的培養基，置37 ℃孵育30 min，棄培養基，加入含ROS探針終濃度為10 μmol/L的培養基，37 ℃避光孵育25 min，PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察、拍照。實驗重復3次。

2.6Western blot檢測細胞內Nox4和α-SMA的蛋白含量低溫提取細胞總蛋白，改良BCA法測定蛋白濃度，每孔上樣50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分離蛋白，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別滴加GAPDH、Nox4和α-SMA(1∶500) I 抗，4 ℃搖床過夜，洗膜，加 II 抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗膜后將超敏ECL發光液滴加到膜上，當條帶充分顯色后，壓X光片，暗室曝光5～10 s，將X膠片進行顯影、定影后可見到清晰條帶。所得膠片經JS-780全自動凝膠成像分析系統進行灰度值分析。實驗重復3次。

3統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件分析數據，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，各組均數間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1白花丹醌對TGF-β1+LY364947作用后HSC-LX2細胞活力的影響

如圖1所示，HSC-LX2細胞經過TGF-β1+LY364947處理后，白花丹醌在0.25～ 2 μmol/L之間對細胞活力的抑制率小于10%，說明白花丹醌在這個范圍內對正常的HSC-LX2細胞的毒性較小。

Figure 1.The effect of plumbagin on the HSC-LX2 cells after treated with TGF-β1 and LY364947. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs0 μmol/L.

圖1白花丹醌對經TGF-β1及LY364947作用后HSC-LX2細胞活力的影響

2白花丹醌對HSC-LX2細胞Nox4 mRNA表達的影響

RT-PCR結果顯示，與空白對照組比較，模型組HSC-LX2細胞中Nox4 mRNA的表達明顯增強(P<0.01)；與模型組相比，2 μmol/L組和1.5 μmol/L白花丹醌作用72 h后，HSC-LX2細胞Nox4 mRNA的表達明顯下降(P<0.01),見圖2。

3白花丹醌對HSC-LX2細胞內ROS水平的影響

原位裝載探針法檢測結果顯示，與空白對照組相比，模型組HSC-LX2細胞內綠色熒光明顯增強，表明ROS水平明顯升高。與模型組相比，Vit E組細胞內綠色熒光信號明顯減弱；白花丹醌各濃度組可不同程度下調ROS的表達，隨著白花丹醌濃度的增加，HSC-LX2細胞內熒光強度明顯減弱且發綠色熒光的細胞數明顯減少，白花丹醌2 μmol/L組與Vit E組細胞內的熒光信號強度相當，見圖3。

Figure 2.The effect of plumbagin on the mRNA expression of Nox4 in the HSC-LX2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control;△△P<0.01vsTGF-β1.

圖2白花丹醌對HSC-LX2細胞Nox4 mRNA表達的影響

4白花丹醌對HSC-LX2細胞Nox4和α-SMA蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，與空白對照組相比，TGF-β1刺激后,HSC-LX2細胞內Nox4和α-SMA的蛋白表達顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，2 μmol/L和1.5 μmol/L濃度白花丹醌作用72 h后，Nox4和α-SMA的蛋白表達減少，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖4。

討論

肝星狀細胞是肝纖維化時產生過量細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主要來源細胞，其活化增殖是肝纖維化形成的關鍵。逆轉肝纖維化關鍵在于減少活化的HSCs數量[13-14]。HSCs活化時具有高度增殖活性并能轉化為高表達α-SMA的肌成纖維細胞，合成大量ECM，故α-SMA的表達被認為是HSCs活化的顯著特征之一[15]

研究顯示，在各種炎癥刺激因子、生長因子和促纖維化因子中，TGF-β1是作用最強的促肝纖維化因子[8-9]，它除了能促進HSCs的增殖與活化，還能通過自分泌機制產生擴增效應。據報道[4，16]，Nox在肝纖維化進程中發揮著重要作用，在肝纖維化動物模型及肝纖維化病人病程中均伴隨Nox4的增加，其通過調節肝細胞的凋亡和肝星狀細胞的活化促進肝纖維化的發展。現已證明，由Nox4產生的ROS是細胞內信號轉導的第二信使[17]，介導了各種促肝纖維化因子在細胞內信號轉導。研究表明，ROS可直接刺激HSCs的增殖與活化，促進肝纖維化的發生[1,18-19]。本研究結果顯示，TGF-β1刺激后模型組HSC-LX2中Nox4 mRNA及蛋白表達明顯增強、ROS水平明顯升高、α-SMA蛋白呈現強表達，表明活化的HSC-LX2細胞模型建立成功。

Figure 3.The effect of plumbagin on ROS production in the HSC-LX2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control;△△P<0.01vsTGF-β1.

圖3白花丹醌對HSC-LX2細胞ROS生成的影響

本課題組前期研究顯示白花丹醌能明顯抑制TGF-β1刺激的HSC-LX2細胞的增殖和活化，IC50為1.72 μmol/L，呈劑量依賴性[11]。本研究結果顯示HSC-LX2細胞經過TGF-β1+LY364947處理后，白花丹醌在0.25～2 μmol/L之間對細胞活力的抑制率小于10%，說明白花丹醌在0.25～2 μmol/L范圍內對正常HSC-LX2細胞的毒性較小，而對TGF-β1刺激的活化型HSC-LX2的生長具有明顯的抑制作用。TGF-β1刺激后模型復制成功后，給予白花丹醌作用72 h，HSCs中Nox4 mRNA及蛋白表達、ROS水平及α-SMA蛋白明顯減少，提示白花丹醌抑制HSCs增殖和活化功能的機制之一可能與抑制Nox4及ROS的表達等抗氧化功能有關，關于其抑制Nox4后ROS生成減少介導的細胞內信號通路的改變有待進一步研究。

Figure 4.The effect of plumbagin on the protein expression of Nox4 and α-SMA in the HSC-LX2 cells detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control;△△P<0.01vsTGF-β1.

圖4白花丹醌對HSC-LX2細胞中Nox4和α-SMA蛋白表達的影響

[參考文獻]

[1]Sanchez-Valle V, Chavez-Tapia NC, Uribe M, et al. Role of oxidative stress and molecular changes in liver fibrosis: a review[J]. Curr Med Chem, 2012, 19(28):4850-4860.

[2]李博，何文華，劉戈云，等. 活性氧簇與肝纖維化發病的研究進展[J]. 國際消化雜志, 2009, 29(2):89-91.

[3]張曉嵐，王占魁，姜慧卿. 氧化應激與肝纖維化[J]. 臨床肝膽病雜志，2007，23(3):226-229.

[4]Sancho P, Mainez J, Crosas-Molist E, et al. NADPH oxidase 4 mediates stellate cell activation and hepatocyte cell death during liver fibrosis development[J]. PLoS One, 2012, 7(9):e45285.

[5]Ikeda R, Ishhii K, Hoshikawa Y, et al. Reactive oxygen species and NAPDH oxidase 4 induced by transforming growth factor beta1 are the therapeutic targets of polyenylphosphatidylcholine in the suppression of human hepatic stellate cell activation[J]. Inflamm Res, 2011, 60(6):597-604.

[6]De Minicis S, Brenner DA. NOX in liver fibrosis[J]. Arch Biochem Biophys, 2007, 462(2):266-272.

[7]Ikeda R, Ishii K, Hoshikawa Y, et al. Reactive oxygen species and NADPH oxidase 4 induced by transforming growth factor β1 are the therapeutic targets of polyenylphosphatidylcholine in the suppression of human hepatic stellate cell activation[J]. Inflamm Res, 2011, 60(6):597-604.

[8]郭銳芳，楊少奇. 以 TGF-β 為靶點的抗肝纖維化治療[J]. 實用肝臟病雜志，2008, 11(5):341-343.

[9]Cheng K, Yang N, Mahato RI.TGF-β1 gene silencing for treating liver fibrosis[J]. Mol Pharm, 2009, 6(3):772-779.

[10]張新華，何文華，朱宣，等. 熊果酸對活化型肝星狀細胞NAPDH氧化酶亞基p47phox表達及ERK1/2信號通路活化的影響[J]. 第二軍醫大學學報，2012, 33(6):590-594.

[11]楊成芳，李勇文，鐘毓娟，等. 白花丹醌對TGF-β1刺激人肝星狀細胞α-SMA表達的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2015, 21(13):139-142.

[12]郝冉冉，王晨靜，仲偉珍，等. 熊果酸對ox-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化損傷的保護作用[J]. 中藥藥理與臨床, 2014, 30(4):29-32.

[13]Shu JC, He YJ, Lv X, et al. Curcumin prevents liver fibrosis by inducing apoptosis and suppressing activation of hepatic stellate cells[J]. J Nat Med, 2009, 63(4):415-420.

[14]Suh YG, Jeong WI. Hepatic stellate cells and innate immunity in alcoholic liver disease[J]. World J Gastroenterol, 2011, 17(20):2543-2551.

[15]Svegliati-Baroni G, DeMinicis S, Marzioni M. Hepatic fibrogenes is in response to chronic liver injury: novel insights on the role of cell-to-cell interation and transition[J]. Liver Int, 2008, 28(8):1052-1064.

[16]Paik YH, Kim J, Aoyama T, et al. Role of NADPH oxidases in liver fibrosis[J]. Antioxid Redox Signal, 2014, 20(17):2854-2872.

[17]Forman HJ, Fukuto JM, Torres M. Redox signaling: thiol chemistry defines which reactive oxygen and nitrogen species can act as second messengers[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2004, 287(2):C246-C256.

[18]Nieto N, Friedman SL, Cederbaum AI. Stimulation and proliferation of primary rat hepatic stellate cells by cytochrome P450 2E1-derived reactive oxygen species[J]. Hepatology, 2002, 35(1):62-73.

[19]Friedman SL. Evolving challenges in hepatic fibrosis[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2010, 7(8):425-436.

*[基金項目]哈醫大一院科研基金(No. 2013Y01)

Effect of plumbagin on levels of Nox4/ROS and α-SMA in human hepatic stellate cellsYANG Cheng-fang, LI Li, LI Yong-wen, ZHONG Yu-juan, XIONG Mei-li, FANG Shu-ping

(GuilinMedicalUniversity,Guilin541004,China.E-mail: 31910753@qq.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of plumbagin on the mRNA and protein expression of nicotinamide adenine dinucleotidephosphate oxidase 4 (Nox4)， reactive oxygen species (ROS) level and protein expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) in the HSC-LX2 cells stimulated with transforming growth factor β1 (TGF-β1) in vitro. METHODS: HSC-LX2 cells were cultured in vitro and divided into blank group, model group, high-, medium- and low-dose (2, 1.5 and 1 μmol/L) plumbagin groups. After incubated with each drug for 72 h, the mRNA expression of Nox4 was detected by RT-PCR. ROS levels were tested by in situ loading probe method. The protein contents of Nox4 and α-SMA were measured by Western blot. RESULTS: Compared with model group, after treated with plumbagin for 72 h, the mRNA expression of Nox4, ROS level and α-SMA protein were significantly decreased in high-and medium-dose plumbagin groups (P<0.01). CONCLUSION: Plumbagin inhibits the activation of HSC-LX2 cells via decreasing the expression of Nox4, thus decreasing ROS levels.

[KEY WORDS]Plumbagin; Transforming growth factor-β1; HSC-LX2 cells; Nicotinamide adenine dinucleotidephosphate oxidase 4; Reactive oxygen species; α-Smooth muscle actin

通訊作者△Tel: 0451-85555208； E-mail： cangsang01@tom.com

[收稿日期]2015- 05- 11[修回日期] 2015- 10- 09

[文章編號](責任編輯： 陳妙玲， 余小慧)1000- 4718(2015)12- 2254- 05

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.023

[中圖分類號]R363.1

[文獻標志碼]A