質譜技術在病原微生物診斷中的應用

吳　傲，張麗軍

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質譜技術在病原微生物診斷中的應用

吳傲1,2，張麗軍1,2

質譜技術因其高靈敏度、特異性、自動化和高通量等特點，被廣泛用于病原微生物蛋白質、多肽等的研究，為病原微生物診斷提供了新技術。本文以基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)和電噴霧(ESI)三重四極桿多反應監測(MRM)質譜技術在微生物診斷中的研究進展進行系統綜述。

MALDI-TOF；MRM技術；微生物；診斷

病原微生物引起的感染性疾病對人類的危害越來越大。近年來，隨著抗菌藥物的濫用導致多種細菌耐藥以及新型細菌的出現，使得臨床上對細菌種類的鑒定工作更加困難。傳統的微生物診斷方法操作過程復雜，所需時間較長，診斷結果存在一定的誤差，在一定程度上影響了病原微生物的診斷以及疾病的控制。因此，臨床上急需一種快速、準確的鑒定方法來改善傳統方法的不足。質譜技術具有高靈敏度、高特異性、高準確度和高通量等特點，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF)技術已經成為商業的微生物鑒定技術；電噴霧離子化(ESI)質譜的多反應監測(MRM)技術正漸漸用于微生物的定量分析。本文從病原微生物診斷的常用方法及其缺陷、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術和ESI的MRM技術在病原微生物診斷中的應用進行系統綜述，為臨床和科研工作者提供幫助。

1　病原微生物診斷的常用方法及其缺陷

傳統的病原微生物鑒定，主要依靠形態學特征、革蘭染色、生理生化反應特征以及血清學反應。但這些鑒定方法一般需要數天才能完成，而且鑒定程序繁瑣[1-2]。近年來隨著分子生物學技術的發展，病原微生物鑒定技術也取得了進展：聚合酶鏈式反應(PCR)技術、實時熒光定量PCR等[3-4]。但是PCR技術由于擴增受外界環境的影響較大，因此仍需尋找高靈敏度、快速和受外界環境影響較少的方法。

2　MALDI-TOF技術在病原微生物診斷中的應用

MALDI-TOF在西方國家臨床微生物實驗室逐漸得到普及，國內研究學者們也逐漸重視其在微生物領域的應用[5-7]。MALDI-TOF能夠用于病原微生物診斷主要基于以下幾點：不同微生物指紋圖譜的差異；指紋中存在種屬、亞種間特異的模式峰；相同的培養和操作條件下其鑒定結果具有可重復性。該方法廣泛用于細菌、真菌等的臨床診斷。

2.1在細菌診斷中的應用

2.1.1MALDI-TOF分析細菌成分MALDI-TOF能完成對細菌多種成分的分析，包括蛋白質、多肽、DNA和RNA及其他能被離子化的分子。細菌蛋白質經過裂解、酶切等過程變成適合質譜分析的肽段，然后用MALDI-TOF采集肽段的質量/電荷(m/z)譜圖(又叫指紋譜)，將每種細菌特定的指紋譜存入數據庫中。臨床樣品分析時，將MALDI-TOF采集的指紋譜與數據庫中進行比對，從完成對病原體的鑒定[8]。此外，每種細菌有其特有的DNA，通過聚合酶連反應(PCR)技術先擴增出特異的核苷酸片段，然后再進行MALDI-TOF檢測[9]，數據庫比對以鑒定相應的病原體。再有，細菌鑒定中MALDI-TOF還用于代謝產物的分析，但是由于細菌的代謝產物在機體內裂解物或培養物中的含量較低，故應用比較局限[9]。

2.1.2應用用于尿路感染中細菌的檢測：王琳等在MALDI-TOF在中段尿樣本細菌直接檢測中的應用中[10]，闡述了MALDI-TOF通過分析細菌蛋白質，從而可以直接檢測不同種類的細菌，并且對混合感染的樣本有一定的鑒別能力，是尿路感染臨床樣本細菌鑒定的一大進步。

用于沙門氏菌的檢測：戰曉微等在沙門氏菌MALDI-TOF檢測方法的建立一文中提出[11]，利用MALDI-TOF方法對沙門氏菌多肽段進行分析，可用于食品中沙門氏菌的快速準確檢測。

用于肺炎鏈球菌的檢測：Branda等對116例非肺炎鏈球菌用MALDI-TOF檢測[12]，只有一例未識別，并且95例肺炎鏈球菌的檢測成功率達到100%。

用于結核分枝桿菌的檢測： Sharma等對結核分枝桿菌細胞膜及膜相關蛋白質進行檢測時[13]，MALDI-TOF技術相對于傳統的測序方法以及色譜法來說，不僅能快速檢測大量未知蛋白質，而且對蛋白質的種類能進行分離，這體現了MALDI-TOF技術在鑒定細菌方面的優勢。

總體來說：MALDI-TOF不但可快速鑒定培養好的純菌落，還可以直接從臨床樣本中檢測微生物。對不同菌株進行鑒定，需氧菌鑒定的正確率高于厭氧菌，革蘭陽性菌高于革蘭陰性菌[14-15]。對于直接從陽性血培養檢測細菌，MALDI-TOF鑒定細菌的正確率為31.8%～95%不等[18-19]。陽性血培養瓶經簡單預處理后進行MALDI-TOF鑒定，陰性桿菌和陽性球菌的鑒定正確率分別為90%和73%[20]。

2.2在真菌診斷中的應用

2.2.1MALDI-TOF分析真菌成分MALDI-TOF用于真菌診斷時主要是對真菌全細胞蛋白、細胞裂解產物進行檢測。葉麗艷等通過獲取真菌全細胞蛋白(主要為核糖體蛋白)[21]，共鑒定出真菌1 254株，質譜技術鑒定真菌共1 198株，占95.53%，未鑒定出真菌占4.47%；應用質譜技術鑒定的真菌中以假絲酵母菌屬為主，共1 125株，占93.91%。Marklein等通過MALDI-TOF技術[22]，對酵母菌裂解物進行處理分析，鑒定準確性達到92.5%。

2.2.2應用用于酵母菌的檢測：目前大部分文獻報道MALDI-TOF主要是用于酵母菌的檢測[23]。已有許多研究對MALDI-TOF 用于酵母菌鑒定的能力進行了評估，發現其鑒定酵母菌的準確性高，準確率達到85.2%[24]。

用于絲狀真菌的檢測：Chierico等對20種共230株絲狀真菌進行MALDI-TOF MS鑒定[25]，他們分別對培養了48 h、72 h、96 h 和120 h 的菌落進行檢測，準確率達到85.9%。

用于皮膚癬菌的檢測：Alshawa 等對360株臨床分離的皮膚癬菌和21株小柱孢屬菌進行MALDI-TOF-MS 檢測[26]，鑒定到種的準確率分別為91.9%(331/360)和85.7%(18/21)，27株皮膚癬菌和3株小柱孢屬菌沒有得到鑒定是因為沒有獲得質譜信號，而只有2株(0.5%)皮膚癬菌鑒定錯誤。

此外，為了提高真菌的檢出率，研究者在樣品收集和提取方面進行了大量的探索。如Lavergne等在發現念珠菌血液標本中混雜的人及肉湯培養中的蛋白可干擾微生物質譜從而影響其鑒定結果后[27]，通過反復離心以及樣品沖洗、改良樣品提取方法，從而將真菌的檢出率提高到100%。

2.3MADLI-TOF質譜技術的局限性以MADLI-TOF為代表的蛋白質譜技術具有快速、準確、靈敏、高通量等特點，加上其自動化和低消耗的優勢而逐漸在臨床微生物實驗室被推廣，并且有望在不久的將來取代傳統的微生物鑒定方法。但是，現階段MADLI-TOF在微生物鑒定中還存在一定的局限性，MADLI-TOF在對病原菌亞種上的鑒定、病原菌的耐藥檢測、人體無菌部位樣品的直接鑒定以及混合病原菌物種的鑒定方面仍有局限[28]；國內由于該技術的研究和應用剛剛起步，尚未建立各種細菌菌株的質譜圖數據庫，而且不同國家和地區的菌株可能存在明顯的地理差異[29]；一些罕見菌種或新型細菌的圖譜尚未被現有數據庫收錄，從而導致鑒定困難；含有混合菌種的血培養樣本難以準確鑒別；同一菌屬中相近的菌種容易錯誤鑒定[30]等。因此有必要發展新的技術以補充MALDI-TOF的不足。

3　MRM技術在病原微生物診斷中的應用

目前用于病原微生物分析的另一主要技術是基于質譜多反應監測(MRM)技術，該技術利用目標分析物的分子結構信息，設定離子對及其質譜檢測方法，然后對設定的離子對進行質譜信號的采集，該技術具有高靈敏度、高特異性的特點，是藥物定量分析的主要手段[31-32]。近年來，隨著質譜靈敏度、檢測質量范圍的提高，MRM定量技術受到了廣大蛋白質研究者的關注[33-34]。

3.1病原微生物的特征蛋白質每種微生物或多或少有其特征蛋白質，目前臨床上的ELISA方法則是利用了病原微生物的這一特點[35]。利用質譜技術對培養微生物特征蛋白質的離子對進行檢測，從而定性定量分析這些微生物。如結核的Antigen 85A、Antigen 85B、 Antigen 85C[36]，金黃色葡萄球菌的葡萄球菌蛋白a[37]，瘋牛病的朊蛋白[38]。

3.2質譜MRM技術在病原微生物診斷中的應用MRM技術可以分析培養的微生物、血液、痰液等各種臨床標本。

常規方法一般是在微生物培養后進行蛋白質抽提，用質譜進行分析。如 Kruh-Garcia等將MRM技術用于Mtb 3種重要的免疫顯性蛋白質(Antigen 85A、Antigen 85B、 Antigen 85C)的檢測[36]，從而達到對Mtb進行診斷的目的；Bonar等利用質譜技術對金黃色葡萄球菌的蛋白質組進行研究[37]，并根據葡萄球菌蛋白a對金黃色葡萄球菌進行診斷；Sturm等使用質譜MRM技術在亞飛摩爾水平絕對定量朊蛋白[38]。

血液是臨床最常用的檢測標本，開發出無需微生物培養，直接進行定量的方法是廣大研究者的追求。Lange等應用MRM技術可以準確定量檢測血漿中鏈球菌低豐度毒力因子[39]，從而達到對鏈球菌的鑒定。Pierce等通過噬菌體擴增技術[40]，結合MRM技術，對金黃色葡萄球菌可以進行定量檢測，分析時間只需3 h，檢測限達到5.0×104CFU m/L，有望用于臨床疾病的診斷。Charretier等闡述了利用SRM質譜技術[41]，以金黃色葡萄球菌為例，對其各種不同肽類進行檢測，其中，I肽類可以鑒定金黃色葡萄球菌到種的水平，R肽類可以檢測其耐藥性，V肽類對其致病因子有很好的表達，T肽類則可以區分不同的型別。Sjoholm等利用SRM技術定量分析人血漿中的M蛋白、F蛋白等[42]，從而對鏈球菌進行鑒定。

痰液是結核病診斷常用的標本，也有研究者正在嘗試用MRM技術檢測結核分枝桿菌。如Nicole等利用MRM方法分析人血清樣品外泌體(exosomes)中的8個結核標志蛋白質 Antigen 85B、Antigen 85C、Apa、BfrB、GlcB、HspX、KatG和Mpt64[43]，從而對活動性和潛伏性結核進行鑒別診斷。Schubert等介紹了SRM不僅僅能夠通過潛伏存活調節子在厭氧條件下的調節來對體外培養的結核分枝桿菌蛋白質進行鑒定和定量檢測[44]，并且能夠用于受感染細胞、動物模型以及臨床樣本(痰液等)中結核的鑒定。

3.3質譜MRM技術的局限性及展望MRM已經在基于蛋白質組學研究的生物標志物研究中呈現強大的應用前景。但是，該技術在蛋白質組學上的應用尚處初始階段，對于MRM在小分子研究領域獲得廣泛應用，許多技術障礙有待攻克。MRM 技術是基于蛋白質或多肽的已知信息或假定信息進行質譜信號采集，有針對性地獲取數據的方式。通過與其他質譜掃描技術的聯合使用，能在蛋白質組研究中充分展現其高靈敏度、高準確性、高重復性、高通量的應用優點。可以預見，通過對MRM技術的進一步優化，未來MRM技術將更多地用于病原微生物診斷，能夠更加準確、快速鑒定微生物，為臨床診斷節約時間。

4　結　論

隨著質譜技術的普及，越來越多的質譜技術用于微生物診斷。MADLI-TOF質譜技術具有快速、準確、靈敏、高通量等特點，同時，也存在不足之處：微生物蛋白指紋圖譜數據庫不夠完善[45]，一些罕見菌種或新型細菌的圖譜尚未被現有數據庫收錄，從而導致鑒定困難；含有混合菌種的血培養樣本難以準確鑒別；同一菌屬中相近的菌種容易錯誤鑒定；直接鑒定時，血培養和尿液樣本中菌量對鑒定有一定的影響。MRM技術相對于MADLI-TOF質譜技術而言，準確度更高，能夠特異識別各種微生物，通量大，能同時分析多個樣品；但是質譜MRM技術蛋白質數據庫仍然不夠完善，仍需不斷進行優化，以期能夠適用于更多方面的研究。總之，隨著質譜技術的發展，以及病原微生物數據庫的完善，MALDI和MRM技術將在病原微生物鑒定方面發揮越來越大的作為，有望成為新一代病原微生物診斷的常規技術。

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Application of mass spectrometry technology in the diagnosis of pathogenic microorganism

WU Ao1,2，ZHANG Li-jun1,2

(1.ShanghaiPublicHealthClinicalCenter，FudanUniversity，Shanghai201508，China;2.WenZhouMedicalUniversity，Wenzhou325000，China)

Mass spectrometry，due to its characters of high sensitivity，specificity，automation and high throughput，etc.，has been widely applied in the studies of proteins and peptides of microorganism，and offered new technologies to diagnose pathogenic microorganism. In this manuscript，we reviewed the application of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and electrospray ionization quadrupole mass spectrometer (ESI Q MS) especially multiple reaction monitoring (MRM) technology in the diagnosis of microorganism.

MALDI-TOF; MRM technology; microorganism; diagnosis

Zhang Li-jun，Email: zhanglijun1221@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.014

張麗軍，Email: zhanglijun1221@163.com

1.上海市公共衛生臨床中心，上海201508；

2.溫州醫科大學，溫州325000

R37

A

1002-2694(2016)09-0838-05

2016-02-24；

2016-04-28

“重大新藥創制”科技重大專項(No.2012ZX09303013)；國家自然科學基金(No.81271834)；國家863課題(No.2014AA021403)；上海市高等級生物安全病原微生物檢測專業技術服務平臺(No.15DZ2290200)聯合資助

Supported by the 12th Five-Year Major New Drug Discovery Science and Technology (2012ZX09303013); the National Natural Science Fund (81271834); the National 863 Project "Study the Key Technology of Personnel Protection and Lab Tracking of pathogenic microorganism" (2014AA021403); Shanghai high-grade biosafety pathogenic microorganism testing professional technical service platform (No. 15 dz2290200)