三氧化二砷誘導人腦SHG-44膠質瘤細胞凋亡

張旭東　崔大勇　王　新　郭云寶　魯質成　張　博

(長春中醫藥大學附屬醫院神經外科，吉林　長春　130021)

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三氧化二砷誘導人腦SHG-44膠質瘤細胞凋亡

張旭東崔大勇王新1郭云寶1魯質成1張博1

(長春中醫藥大學附屬醫院神經外科，吉林長春130021)

〔摘要〕目的觀察三氧化二砷(As2O3)對SHG-44膠質瘤細胞增殖抑制的分子機制。方法在加入SHG-44膠質瘤細胞As2O348 h后，采用四甲基偶氮唑藍比色(MTT)方法檢測細胞增殖抑制率；RT-PCR及蛋白免疫印跡(WB)方法，檢測BAX及Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平。結果As2O3對SHG-44膠質瘤細胞的抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強；BAX mRNA及蛋白表達水平與對照組比無明顯變化(P<0.05)，BAX mRNA及蛋白表達明顯降低(P<0.05)。結論As2O3通過促進細胞凋亡而抑制SHG-44膠質瘤細胞的增殖。

〔關鍵詞〕三氧化二砷;膠質瘤；細胞凋亡

1吉林大學第一醫院神經血管病外科

第一作者：張旭東(1978-)，男，主治醫師，主要從事神經血管病的研究。

神經膠質瘤是常見的顱內惡性腫瘤，其發病率高，生長速度快〔1〕。目前，臨床上在進行膠質瘤治療時常采用手術切除為主，放、化療為輔的治療方法。但是，患者在治療后，1年的生存率低于50%，而兩年的生存率更是不及10%。目前研究發現三氧化二砷(As2O3)不僅可以治療血液腫瘤，還可以對其他實體腫瘤有作用，而且關于As2O3對人腦SHG-44膠質瘤細胞的作用也知之甚少。本研究圍繞As2O3誘導膠質瘤(SHG-44)細胞凋亡的機制展開，為As2O3將來用于腦內膠質瘤的臨床應用提供可靠的實驗依據。

1材料與方法

1.1細胞培養及分組實驗中使用的人腦SHG-44細胞由中科院上海細胞研究所提供。實驗分為對照組、加As2O31 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L。

1.2儀器與試劑Trizol、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Taq酶及M-MuLV等購自寶泰克生物試劑公司。二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中山生物技術公司，BAX及Bcl-2單克隆抗體及辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG(H+L)購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.3MTT比色法測定細胞增殖抑制率將SHG-44細胞制成1×105/ml的單細胞懸液，接種于96孔培養板中，每孔100 μl。孵育24 h后加入10 μl不同濃度的As2O3，對照組加生理鹽水。孵育48 h后，各孔加入20 μl 濃度為5 g/L的MTT，繼續培養4 h后使用酶聯免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長處吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

1.4RT-PCR將加入As2O348 h后的SHG-44細胞按說明書提取總RNA，并進行逆轉錄及基因片段擴增。引物序列：甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'，5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3'(452 bp)；Bcl-2：5'-AAC ACC AGA ATC AAG TGT TCG-3'，5'-TCA GGT GGA CCA CAG GTG GC-3'(446 bp)；Bax：5'-AGG GTT TCA TCC AGG ATC GAG C-3'，5'-AGG CGG TGA GGA CTC CAG CC-3'(468 bp)。PCR總反應體積為25 μl ,共30個循環(94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s)，取PCR產物進行電泳，拍照、存盤。

1.5蛋白免疫印跡法(WB)提取各組細胞的總蛋白，Bio-Rad法測定各樣本中總蛋白含量。然后40 μg進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉膜、封閉、加一抗4℃過夜、洗滌、加入二抗、再洗滌，最后顯色。SHG-44細胞的生長抑制率(IR)=(1-藥物作用組OD值/對照組OD值)×100%。

1.6統計學分析采用SPSS11.0軟件，組間比較行t檢驗。

2結果

2.1不同濃度的As2O3對 SHG-44細胞增殖活性的影響不同濃度的As2O3作用于SHG-44細胞48 h后，根據測得OD值計算抑瘤率，結果顯示，As2O3對SHG-44膠質瘤細胞的抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強：1 μmol/L As2O3的IR為(17.63±1.43)%，2 μmol/L時IR為(30.91±2.93)%，4 μmol/L時為(36.77±5.35)%，8 μmol/L時為(50.77±2.81)%。

2.2As2O3對 SHG-44 膠質瘤細胞凋亡基因Bax及核蛋白因子Bcl-2 mRNA的影響RT-PCR的電泳結果顯示，分使用1、2、4、8 μmol/L 的As2O3作用于SHG-44細胞48 h后，Bax mRNA的表達含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44細胞相比沒有明顯的變化(P>0.05)；而Bcl-2 mRNA的表達含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44細胞相比，隨著As2O3濃度的增加而減少(P<0.05)。見圖1，圖2。

圖1　凝膠電泳檢測SHG-44神經膠質瘤細胞Bax、Bcl-2 mRNA表達

圖2　SHG-44神經膠質瘤細胞Bax、Bcl-2 mRNA相對表達量

2.3As2O3對SHG-44細胞凋亡基因Bax及核蛋白因子Bcl-2蛋白的影響分別使用1、2、4、8 μmol/L 的As2O3作用于SHG-44膠質瘤細胞48 h后，Bax蛋白的表達含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44膠質瘤細胞相比沒有明顯的變化(P>0.05)；而Bcl-2蛋白的表達含量與未使用As2O3(0 μmol/L)的SHG-44膠質瘤細胞相比，隨著As2O3濃度的增加而減少(P<0.05)。見圖3，圖4。

圖3　SHG-44神經膠質瘤細胞中Bax、Bcl-2蛋白表達

圖4　SHG-44神經膠質瘤細胞Bax、Bcl-2蛋白表達OD值

3討論

As2O3作為砒霜的主要組成成分，白色粉末，易升華，無特殊氣味，微溶于水，易溶于堿和酸。《本草綱目》就曾記載使用砒霜等含有砷成分的藥物治療哮喘、梅毒等。1999年通過了國家藥品監督管理局的審批，臨床上在2000年開始作為治療APL而廣泛應用〔2〕。本研究結果表明As2O3對SHG-44膠質瘤細胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈劑量依賴性。

細胞凋亡指的是由多個有功能聯系的基因激活后引起的蛋白表達以及調控等的作用引起細胞程序性的死亡，是所有生命體都具有的一種基本特征。目前研究表明抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax在細胞凋亡的過程中發揮重要的作用〔3〕，其機制與影響線粒體的功能結構與穩定性〔4～6〕有關。有報道指出〔7〕，細胞凋亡的發生在一定程度上取決于抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白之間的比例，如Bax/Bcl-2比值高的細胞，比Bax/Bcl-2比值低的細胞更易發生凋亡，相反不易發生凋亡。本實驗說明As2O3誘導了細胞凋亡的發生。

綜上所述，As2O3在體外可以通過促進細胞凋亡而抑制SHG-44膠質瘤細胞的增殖。

4參考文獻

1王忠誠.神經外科學〔M〕.武漢:湖北科學技術出版社,1998:424-32.

2Kunrath J,Gurzau E,Gurzau A,etal.Blood pressure hyperreactivity:an early cardiovascular risk in normotensive men exposed to low-to-moderate inorganic arsenic in drinking water〔J〕.J Hypertens,2013;31(2):361-9.

3Hu RG,Lim J,Donaldson PJ,etal.Characterization of the cystine/glutamate transporter in the outer plexiform layer of the vertebrate retina〔J〕.Eur J Neurosci,2008;28(8):1491-502.

4Pacitti D,Wang T,Page MM,etal.Characterization of cytosolic glutathione peroxidase and phospholipid-hydroperoxide glutathione peroxidase genes in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and their modulation by in vitro selenium exposure〔J〕.Aquat Toxicol,2013;130-1:97-111.

5Yildiz D,Cakir Y.Efflux of glutathione and glutathione complexes from human erythrocytes in response to inorganic arsenic exposure〔J〕.Biol Trace Elem Res,2012;150(1-3):451-9.

6Dang TN,Arseneault M,Ramassamy C.Regulation of redox-sensitive signaling pathways in rat primary astrocytes following acrolein exposure〔J〕.J Alzheimers Dis,2011;25(2):263-77.

7Maubach G,Sokolova O,Wolfien M,etal.Ca2+/calmodulin-dependent kinase Ⅱ contributes to inhibitor of nuclear factor-kappa B kinase complex activation in Helicobacter pylori infection〔J〕.Int J Cancer,2013;133(6):1507-12.

〔2015-03-21修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：張博 (1981-),男，主治醫師，主要從事神經血管病的研究。

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6358-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.018