欖香烯和VEGF多克隆抗體聯合應用對大鼠腦膠質瘤增殖的影響①

李英夫，李明軍，廉曉宇，宣兆博

(佳木斯大學附屬第一醫院神經外科,黑龍江 佳木斯 154003)

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欖香烯和VEGF多克隆抗體聯合應用對大鼠腦膠質瘤增殖的影響①

李英夫，李明軍，廉曉宇，宣兆博

(佳木斯大學附屬第一醫院神經外科,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的:對Wistar大鼠腦膠質瘤增殖中應用VEGF多克隆抗體與欖香烯聯合應用的抑制效果進行分析與探討。方法：構建Wistar大鼠腦膠質瘤模型，此模型為腦膠質瘤模型，膠質瘤細胞為SHG-44，大鼠接種成瘤后將其隨機分為4組，每組大鼠8只，A組大鼠給予生理鹽水，B組大鼠給予欖香烯，C組大鼠給予VEGF多克隆抗體，D組大鼠給予VEGF多克隆抗體與欖香烯。鏡下對腫瘤組織病理切片進行觀察。結果：研究組腫瘤標本壞死灶較多，腫瘤細胞中含有大量核破裂，而對照組腫瘤標本具有較多血管數量，血管管壁增厚，腫瘤血管減少量與組織壞死程度D組明顯多于B組與C組。結論：研究表明，VEGF多克隆抗體與欖香烯聯合使用對腫瘤組織生長具有有效抑制作用，具有協同作用，VEGF多克隆抗體與欖香烯對細胞凋亡具有促進作用，兩者聯合使用存在協同效應。

關鍵詞：VEGF多克隆抗體；欖香烯；Wistar膠質瘤模型

本研究為對Wistar大鼠腦膠質瘤增殖中應用VEGF多克隆抗體與欖香烯聯合應用的抑制效果進行分析與探討，構建Wistar大鼠腦膠質瘤模型，具體報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

由吉林醫學院生化研究機構提供膠質瘤細胞株，并從佳木斯大學動物實驗中心購置Wistar大鼠，選用美國BD公司生產的流式細胞儀，日本CK公司生產的倒置顯微鏡，L eica CM1100切片機。

1.2方法

1.2.1動物接種與分組

通過酒精與強力碘為大鼠背部進行消毒，6號針頭注射器將1mL大鼠細胞懸液抽取出來，接種在大鼠腦部尾狀核，并于每2d對腫瘤生長情況進行觀察，5d左右即可觸及皮下腫瘤，14d皮下腫瘤直徑就可達15mm，把呈橢圓形或者圓形，直徑大約15mm生長合格的腫瘤當作試驗腫瘤模型，隨機分為4組，每組有大鼠8只，將其分開飼養，且命名為A、B、C、D組，A組(對照組)大鼠給予生理鹽水，B組(研究組)大鼠給予欖香烯，C組(研究組)大鼠給予VEGF多克隆抗體，D(研究組)組大鼠給予VEGF多克隆抗體與欖香烯。

1.2.2懸液制備與細胞培養

SHG-44來源于人額葉星形膠質瘤的穩定培養，具有特異性標志膠質酸性纖維蛋白(GFAP)，SHG-44是目前較理想的細胞株，能夠穩定的培養，并在Wistar大鼠尾狀核區成功植入，將復蘇成功的SHG-44細胞株，放于50cm2培養瓶中接種，DMEM培養基中含有10%滅活的胎牛血清，還含有鏈霉素100mg/mL、青霉素100U/mL、NaHCO33.7g/L，培養瓶置于5%CO2的培養箱中，溫度恒定于37℃，SHG-44細胞滿瓶后,將培養液傾倒出去,0.25%胰酶消化培養瓶中的SHG-44細胞,顯微鏡下觀察SHG-44細胞，當細胞開始皺縮時,加入營養液,并反復吹打，使SHG-44細胞脫壁,并用離心機離心5min，離心轉數為1000r/min，將上清液棄出，制成106細胞/瓶的細胞懸液,接種于25cm2培養瓶中[1]。

1.2.3動物模型制作前準備

全實驗過程每周兩次注射地塞米松，0.15mg腹腔內注射，接種前3d，每日給予地塞米松，劑量為100g體重1mg，給藥方式為灌胃，降低排斥反應，用10%水合氯醛麻醉，給藥劑量為每10g體重0.4mL，剪去穿刺點周圍毛，面積約1.0cm×1.5cm。

1.2.4模型制作

植入靶點為右側尾狀核區，穿刺點為矢狀縫右旁開3.5mm和前囟中點前1.0mm，麻醉滿意后，將Wistar大鼠固定于立體定向儀上，剪去穿刺點周圍毛,高效碘消毒,鋪無菌洞巾，切開內眥連線與正中矢狀面交點向后1mm，定位預先穿刺點，牙科鉆顱骨鉆孔，直徑1.2mm，用1mm微量注射器針頭刺破硬膜，向下垂直進入硬膜下6mm, 再后撤1mm，將細胞懸液1×106/20μL，以每分鐘1μL的速度緩慢注入右側尾狀核區，穿刺針停留5min，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮[1]。

1.2.5給藥方法

VEGF多克隆抗體給藥量為50 只，欖香烯為20mg/kg,根據1mg:1000mL的比例對VEGF多克隆抗體進行稀釋， 1%欖香烯劑型是20mL中含20mg，通過生理鹽水將欖香烯配置為100mL中含100mg，大鼠腹腔隔日給予VEGF多克隆抗體與欖香烯。

1.3腫瘤病理學觀察

10%中性甲醛固定腫瘤組織，石蠟包埋，5μm層厚切片，HE常規染色，并于光鏡下對組織切片進行分析。7d時進行頭部MRI檢查，將成瘤的大鼠作為實驗對象，分別于接種后的7、14、21d、自然死亡的幾個時間點觀察大鼠的生存狀態，包括如下幾個方面：飲食情況；肢體是否有活動障礙；顱神經是否有功能確實；以及視覺反應；全身抽搐和持續時間等。21d處死大鼠和死亡的大鼠進行HE染色，光鏡下觀察。

1.4統計學方法

采用SPSS13.0軟件進行統計學處理，兩組采用Q檢驗，方差分析多組，P<0.05為差異具有統計學意義。

2　結果

2.1腫瘤病理學觀察

在光鏡下對Wistar大鼠膠質瘤標本進行觀察發現呈小梭形，具有較大細胞核，呈異形，易發現核分裂相，染色質豐富，很少有細胞質，細胞略微突起，研究組腫瘤標本壞死灶較多，腫瘤細胞中含有大量核破裂，腫瘤血管減少量與組織壞死程度D組明顯多于B組與C組。

2.2各組影響腫瘤細胞凋亡機制

A、B、C、D組細胞凋亡率分別是(0.47±0.18)%、(13.0±1.60)%、(11.8±1.60)%、(19.5±1.31)%，組件腫瘤細胞凋亡率相比，差異性比較明顯，具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1　各組標本腫瘤細胞凋亡率

3　討論

臨床中，神經質瘤具有較高的發病率，而且是一種比較常見的顱內惡性腫瘤，其所占比例大約為37.5%~60.5%，目前在治療該方面的進展也比較慢，現階段常規治療膠質瘤主要是手術治療，術后再行化療與放療。近年來，闡明腫瘤血管病理生理后，為治療腫瘤開辟更多新途徑。VEGF(血管內皮生長因子)對血管發生與形成具有調節作用，在形成腫瘤過程中具有關鍵作用[3]。而且VEGF抗體可結合循環VEGF，是VEGF蛋白構向得以轉變，有效遏制VEGFR和VEGF結合位點，避免VEGF結合內皮細胞VEGFR，對VEGF信號通路具有阻斷作用，有效抑制內皮細胞遷移與增殖，而且對血管形成也具有抑制性作用[4]。欖香烯提取物為姜科植物溫郁金，其主要成分為β-欖香烯，屬于萜烯類化合物，且含少量γ與α欖香烯，相關藥理學研究發現，欖香烯能夠有效殺傷與抑制體內腫瘤細胞。臨床研究顯示，在多種腫瘤中，欖香烯療效確切，而且能夠有效對抗神經膠質瘤。本研究結果顯示，研究組腫瘤標本壞死灶較多，腫瘤細胞中含有大量核破裂，而對照組腫瘤標本具有較多血管數量，血管管壁增厚，腫瘤血管減少量與組織壞死程度D組明顯多于B組與C組。研究表明，VEGF多克隆抗體與欖香烯聯合使用對腫瘤組織生長具有有效抑制作用，具有協同作用，VEGF多克隆抗體與欖香烯對細胞凋亡具有促進作用，兩者聯合使用存在協同效應。

參考文獻：

[1]關曉燕. 欖香烯對人膠質瘤U251細胞株體外放射增敏機制研究[J].中南大學，2012:123-124

[2]李英夫，李明軍. Wistar 大鼠SHG - 44 腦膠質瘤動物模型建立[J].黑龍江醫藥科學，2015，38(2)：24-25

[3]許浪,劉丹.欖香烯誘導肺癌A549細胞凋亡作用的劑量和時間依賴性研究[J].中國現代藥物應用，2009,(6):108-109

[4]廉曉宇，李顯偉.欖香烯和VEGF多克隆抗體聯合應用對C6膠質瘤增殖抑制作用的研究[J].黑龍江醫藥科學，2009，32(1)：14-15

中圖分類號:R742

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2015)06-0099-02

作者簡介：①李英夫(1979～)男，黑龍江明水人，碩士，主治醫師。

通訊作者：李明軍(1965～)男，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫師。E-mail:liyingfu79@sohu.com。

(收稿日期：2015-07-03)