Smad-4在結直腸癌的表達及評價患者預后的研究①

王星權，王亞洲，陳玉強，王躍生，呂　鑫

(佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

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Smad-4在結直腸癌的表達及評價患者預后的研究①

王星權，王亞洲，陳玉強，王躍生，呂鑫

(佳木斯大學臨床醫學院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的: 借助免疫組化方法檢測結直腸癌及癌旁組織中Smad-4的表達情況，評估Smad-4作為結直腸癌患者預后評估指標的可能性。方法:采用免疫組化法檢測97例結直腸癌組織及37例癌旁組織中Smad-4的表達情況，結合患者的臨床隨訪資料數據回顧性分析患者腫瘤標本中Smad-4的表達量與患者術后總體無瘤生存兩者之間的關系。結果:一定比例的(63例)結直腸癌腫瘤組織中可見Smad-4蛋白的顯著表達，其陽性表達率為64.94% [63/97]，高于癌旁、正常結直腸黏膜細胞，在結直腸癌旁組織中的陽性表達率為(6例)16.21%[6/37]，兩者比較，差異具有顯著的統計學意義(P<0.05)；而且證實Smad-4蛋白表達高、低兩組患者的術后生存情況有顯著差異(P<0.05)。結論：Smad-4蛋白在結直腸癌患者組織中存在高表達，在患者腫瘤組織中存在Smad-4高表和低表達的兩類患者中，其臨床預后存在顯著的統計學差異。Smad-4蛋白可以有條件的作為評估術后結直腸癌患者臨床預后的蛋白標記物。

關鍵詞：Smad-4；結腸癌；免疫組化

近些年來，結直腸癌在我國的發病率逐年增高，結直腸癌一直是我國消化系腫瘤研究領域的重點關注項目，是最常見的惡性腫瘤之一[1]。2008年，全球有超過120萬的結直腸癌新發病例，其死亡率約占全部惡性腫瘤的8%[2]其是發病率和死亡率均較高的惡性腫瘤,其浸潤和轉移程度是影響預后的主要因素[3]。Smad-4蛋白的基因定位于常染色體18q21，其所編碼的Smad-4蛋白是TGF-β1 信號轉導通路發揮功能時所涉及的必須的介導分子蛋白，對維持機體細胞正常的生長、發育起著重要的作用，兩者數量、結構、功能上的穩定性是TGF-β1 在細胞內外不同環境下發揮多種生理、病理功能并產生各種生物學效應的關鍵，這其中涉及到腫瘤的發生、發展病理生理過程[4]。多項研究均證實Smad蛋白家族和腫瘤的關系十分密切，在很多實體瘤和非實體腫瘤中都有明確表達和病理學意義[5,6]。 本課題擬通過考察Smad-4在結直腸癌中的表達情況同時整合結直腸癌患者的術后隨訪資料，同時考查其在評價結直腸癌患者臨床預后方面的意義以及將Smad-4作為評價結直腸癌患者預后參考指標的可能性，從而對臨床結直腸癌患者術后的生存預測、指導患者綜合治療方案的實施有意義。

1　材料和方法

1.1標本來源與分組

實驗組：結直腸癌標本組織來源及病例選擇、納入標準選取2006-02～2008-12佳木斯大學附屬第一醫院住院結直腸癌根治術的患者病理標本。研究期間共查找到164例病歷資料或記錄明確因結直腸癌而在我院行結直腸癌根治術治療的患者，根據納入研究標準篩選接受結直腸癌根治術且已經獲取確切隨訪資料的結直腸癌標本共計97例。所有患者標本均經病理證實為結直腸癌，術前未接受任何術前放、化療及其他抗腫瘤治療，術后患者均根據NCCN指南而采用正規腫瘤內科的化療或放療。所有納入研究的患者接受的手術術式均為結直腸癌根治術。對照組：癌旁或正常的結直腸組織標本37例標本，取自結直腸癌對應的周邊組織，或良性腫瘤的外圍組織，病理切片HE檢查證實未受癌侵潤及未發生癌變。記錄主要針對以下幾項內容：患者已經死亡者(詢問其死亡時間、死亡原因是否與結直腸癌相關)；患者仍存活(詢問患者目前的生存狀態、荷瘤生存、無病生存，如為腫瘤復發，荷瘤生存則記錄腫瘤復發時間或發生轉移的時間)；無法隨訪(失訪)，記錄失訪時間；如隨訪期限內患者死亡，證實患者死亡原因，依據患者死亡原因是否與結直腸癌相關，若死于非結直腸癌或其他疾病、并發癥，則歸屬失訪。所有患者的隨訪結果依照設計的隨訪內容表格進行，截至實驗隨訪結束時，所有完成隨訪的患者107例中有31例術后存活，生存期超過5年者計37例，占同期結直腸癌手術患者總數的34.6%；70例死亡，死于轉移者30例，死于結直腸癌復發者36例，另有4例死于其他疾病。12例發生復發或轉移但截至隨訪結束時仍存活。

1．2試劑和材料

免疫組織化學所采用的主要試劑是：山羊Smad-4多克隆抗體，；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗、免疫組化試劑盒、DAB顯色劑等；另外實驗采用的其他試劑詳見下文列述。

1.3實驗方法

所有結直腸癌組織的標本均經4%中性甲醛固定，石蠟包埋后貯存。確診為結直腸癌后，采用兩步法進行免疫組組織化學染色。對貯存時間3年內的標本采用pH8.0的EDTA修復液，貯存時間超過3年的病理標本切片采用pH6.0的檸檬酸鹽抗原修復液。石蠟包埋組織切片采用免疫組織化學兩步法檢測結直腸癌標本中Smad-4的表達，所使用的第一抗體為山羊多克隆抗體，以已知的陽性切片作為陽性對照，陰性對照以PBS代替一抗。切片染色后由兩位專業副高職稱的病理科醫師分別盲評閱片、評定以確定切片各自的陽性結論。

1.4結果判定

1.4.1Smad-4表達的檢測及評價

每張染色確定成功的切片隨機選取5個有效視野，摒棄切片的邊緣、組織切片的炎癥壞死區、大血管經過區、切片刀痕、切片撈片過程中形成的皺折、壞死或擠壓重疊區域。圖像分析系統對已判定陽性切片進行判定及計算陽性腫瘤細胞的百分率：先在100倍光鏡掃視整個切片，后在400倍光鏡下隨機取5個視野，取其平均值作為結果。

1.4.2染色判定

以每個視野下的陽性細胞計數占該視野下總體細胞百分率(點密度陽性率)以陽性細胞數低于10%記為為陰性；10%~25%計為“+”；25%~50%計為“”；50%~75%計為“”；>75%計為“”。

1.5統計學方法

采用統計軟件包SPSS13.0進行，P<0.05為差異存在統計學意義。

2　結果

2.1Smad-4在結直腸癌組織中與癌旁組織內的表達

本研究發現，結直腸癌與癌旁組織Smad-4的表達染色情況經兩獨立樣本秩和檢驗，其存在的差異具有統計學意義。見表1。(后續統計時以陰性“+，”納入統計)

表1　Smad-4在結直腸癌及癌旁組織中的表達

2.2Smad-4表達與預后生存期的關系

采用Kaplan-Meier法進行的患者生存分析結果證實：Smad-4的高表達與患者的無病生存期關系密切，即結直腸癌組織中具有Smad-4高表達的患者，其術后總體生存期較低表達組患者為好，兩相比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1　Smad-4高表達組與低表達組患者的術后總生存情況

Kapla-Meier法生存分析:其結果顯示Smad-4高表達組(藍線)與低表達組(綠線)患者的術后總生存情況，差異性存在統計學意義(P<0.05)。

3　討論

結直癌為胃腸道常見的惡性腫瘤之一，近年來在我國的發病率有明顯的增高趨勢[7]。Smad-4基因是首先在胰腺癌中發現的新型腫瘤抑制基因，其所編碼的產物蛋白Smad-4是TGF-β/Smad信號轉導通路中最為重要的信號轉導分子，在該信號轉導將外界刺激信號轉導至胞核內，繼而調控靶基因轉錄、翻譯的過程中發揮著關鍵作用[8]。業已證實，TGF-β/Smad信號轉導通路各關鍵蛋白的的表達下降或生化功能失活參與了腫瘤的發生、發展[9]，這點與本實驗中發現的Smad-4蛋白的表達下降與結直腸癌患者術后的不良預后相關。除此傳統的抑癌功能之外，研究證實Smad-4蛋白還具備一些獨立于TGF-β/Smad信號轉導通路之外的生化功能，參與調控細胞內其他相關基因的表達[10]。通過完成此項課題，我們發現結直腸癌組織中Smad-4的表達與患者的臨床病理學指標、患者預后等存在著密切的關系。實驗結果證實，Smad-4在結直腸癌中存在較高的表達率，Smad-4陽性表達的患者其生存率要高于陰性患者，其兩相比較差異性具有統計學意義(P<0.05)，其總體患者的中位生存時間也是表達陰性者的近兩倍，充分說明Smad-4在結直腸癌患者中具有重要的臨床評估價值和意義。總體上講，結直腸癌患者的預后評估應該將Smad-4的表達情況與該腫瘤患者的其他臨床病理資料結合起來進行無疑更科學、合理、準確，建議臨床上經大樣本、更嚴格的統計學檢驗后推廣應用。

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Clinical outcomese expression of Smad-4 in colorectal cancer tissues, its
signal mechanism and its role in the evaluation of patients’ clinical outcomes

WANGXing-quan,WANGYa-zhou,CHENYu-qiang,WANGYue-sheng,LüXin

(Clinical Medical College of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Abstract:Objective: To detect colorectal cancer and paracancerous tissues Bby means of immunohistochemical Smad-4 method of detecting colorectal cancer and paracancerous tissues,so as to assesssment of the potential of Smad-4 as the prognosis of patients with colorectal cancer assessment index. Methods: Expression of Smad-4 was detected by immunohistochemistry in 97 cases of colorectal carcinoma tissues and 37 cases of para carcinoma tissues, combined with clinical füollow-up data of a retrospective analysis of expression of Smad-4 in tumors from patients in patients after general no relationship between survival of both. Results: Certain proportion (63 cases) was significantly expressed Smad-4 protein in colorectal cancer tissues,the positive expression rate of [63/97] was 64.94%, higher than that of adjacent normal colorectal mucosa, the positive expression in cells, tissues adjacent to colorectal cancer in the rate of (6 cases) 16.21% [6/37], (P<0.05).The comparison between the two was, different with statistical significance significant differences in the expression of Smad-4 protein and confirmed that ; high, low of the two groups of patients with postoperative survival have significant differences (P<0.05).Conclusions: Smad-4 protein has high expression in tissue of patients with colorectal cancer, there are two kinds of patients with higher Smad-4 surface and low expression in cancer tissue, there was a significant difference, the clinical prognosis. Protein marker Smad-4 protein can be used to evaluate the clinical outcome of patients with rectal cancer after operation nodes of conditional.

Key words:Smad-4;colorectal cancer;immunohistochemistry

中圖分類號：R735.3+7

文獻標識碼：B

文章編號：1008-0104(2015)06-0077-02

作者簡介:①王星權(1988～)男,黑龍江佳木斯人,在讀碩士研究生。

通訊作者:王亞洲(1956～)男,黑龍江佳木斯人,碩士,主任醫師,教授,碩士研究生導師。E—mail:sln.shm.ily@163.com。

(收稿日期：2015-03-13)