左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中μ-calpain及caspase-3表達的影響①

韓麗萍，王海燕，喬　霜，鄒艷紅，裴艷瑩

(1.佳木斯大學附屬第一醫院, 黑龍江 佳木斯 154003；2.牡丹江醫學院第二附屬醫院，黑龍江 牡丹江 157009)

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左乙拉西坦對癲癇大鼠海馬組織中μ-calpain及caspase-3表達的影響①

韓麗萍1, 2，王海燕1，喬霜2，鄒艷紅1，裴艷瑩1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院, 黑龍江 佳木斯 154003；2.牡丹江醫學院第二附屬醫院，黑龍江 牡丹江 157009)

摘要：目的：通過觀察LEV對癲癇大鼠認知情況及海馬組織中μ-calpain和caspase-3表達的影響，來探討LEV的抗癲癇作用及其機制。方法：取3周齡Wistar大鼠隨機分為4組：NS組、LEV組、Li-pilo組和Li-pilo+LEV組。采用氯化鋰-匹羅卡品誘導建立癲癇大鼠模型，建模成功24 h后，LEV組和Li-pilo+LEV組分別給予200 mg/(kgod) LEV。采用Morris水迷宮評價大鼠的學習與記憶的能力，免疫組織化學法檢測各組大鼠海馬組織中的μ-calpain及caspase-3的表達水平。結果：①與NS組相比，LEV組的逃避潛伏期和穿越平臺次數無顯著差異 (P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的逃避潛伏期顯著縮短，而穿越平臺次數則顯著增加(P<0.05)，但未恢復到正常水平。②與NS組相比，LEV組的μ-calpain和caspase-3的蛋白表達無顯著變化(P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的μ-calpain和caspase-3的蛋白表達則顯著減少(P<0.05)，但未恢復到正常水平。結論：LEV 可以改善癲癇大鼠的學習和記憶的能力，該作用可能是通過調節海馬組織中的μ-calpain及caspase-3的表達實現的。

關鍵詞：左乙拉西坦；癲癇；μ-calpain；caspase-3

癲癇(epilepsy)是神經系統最常見的疾病之一，全球約有3500萬患者，患病率為5%～7%，而我國也約有650萬患者正在遭受該病的困擾。癲癇是一組以腦部功能失常為特征的綜合征，具有突然的發作性，重復性，和短暫性為特點。可以說是兒童期最為常見的神經系統疾病之一。而癲癇持續狀態(status epilepticus, SE)是癲癇的嚴重狀態，是癲癇反復發作或持續狀態，可以造成神經細胞的凋亡和壞死，并引起認知功能的損害。左乙拉西坦(Levetiracetam, LEV)作為國際上公認的一種抗癲癇藥物(antiepileptic drugs, AEDs)的新品種，憑借其獨特的抗癲癇機制，臨床效果的高效和安全性及良好的藥物動力學特點，目前已經在國內和歐美廣泛應用于對癲癇的治療。LEV具有抗癲癇和神經保護雙重作用[1]。王海燕等[2]在研究中發現左乙拉西坦在治療癲癇的同時,還會改善癲癇大鼠的認知功能。張巖等[3]在左乙拉西坦對癲癇大鼠認知功能的影響研究中也觀察到，左乙拉西坦可改善癲癇大鼠的學習記憶能力。本研究主要采用免疫組織化學染色法檢測LEV對癲癇大鼠海馬組織中μ-鈣蛋白酶(μ-calcium-activated non-lysosomal protease，μ-calpain)及半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表達的影響，并采用Morris水迷宮法檢測大鼠空間記憶和學習能力，來探討LEV抗癲癇作用的機制及其對認知的影響。

1　材料與方法

1. 1實驗動物及模型制備

取三周齡健康Wistar大鼠(55±10g)124只(佳木斯大學動物實驗中心提供)，雌雄不限，隨機的分為4組：正常對照組(NS)28只，左乙拉西坦對照組(LEV)28只，癲癇對照組(Li-pilo)34只，左乙拉西坦治療組(Li-pilo+LEV)34只。

參考文獻[4]制備癲癇大鼠模型：Li-pilo組和Li-pilo+LEV組的大鼠首日腹腔注射1.27%氯化鋰127mg/kg，24h后再給予M膽堿受體阻滯劑丁溴東莨菪堿1mg/kg，30min后腹腔注射1% 匹羅卡品100mg/kg。觀察大鼠行為變化的情況。根據Racine分級標準[5]，將達到Ⅲ～Ⅴ級進入癲癇持續狀態的大鼠歸于致癇成功組；未達到Ⅲ～Ⅴ級的大鼠，繼續注射匹羅卡品直至注射次數達到6次，若注射6次后仍未達到標準，則歸于致癇不成功組，棄之不要。將造模成功大鼠繼續分為Li-pilo組和Li-pilo+LEV組。NS組及LEV 對照組均在相同時間點給予等體積的生理鹽水。

1.2方法

1.2.1給藥方案

Li-pilo+LEV組和LEV組在成模24h后給予200mg/(kgod) LEV灌胃，Li-pilo組和NS組給予等體積的生理鹽水灌胃，每日在相同時間點給予一次灌胃。

1.2.2留取標本及檢測指標

(1)癲癇模型制備成功24h后，采用Morris水迷宮法每日測試各組大鼠的行為學指標：①定位航行實驗：每天分為2個時間段，每個時間段訓練大鼠4次，一共需要4d完成，觀察并記錄大鼠在60s內找到平臺的時間(逃避潛伏期，escapelatency)，反應大鼠空間學習和記憶能力；②空間搜索實驗(spatial probe test)：即在第5d將平臺撤掉，觀察和記錄大鼠90s內穿越平臺的次數，用于測量大鼠對空間位置的記憶能力。

(2)LEV給藥后的第7、14、28天每組隨機選取8只大鼠，給予10%水合氯醛麻醉之后，斷頭處死，分離出大鼠的海馬組織，在 -70℃給予保存，免疫組化染色法檢測大鼠海馬組織中μ-calpain及caspase-3的表達情況。

1.2.3檢測試劑

LEV購于美國Sigma公司；μ-calpain及caspase-3抗體及免疫組化試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3統計學方法

2　結果

2.1Morris水迷宮測試

與NS組相比，LEV組的逃避潛伏期和穿越平臺次數無顯著差異 (P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的逃避潛伏期顯著縮短，而穿越平臺次數則顯著增加(P<0.05)，但未恢復到正常水平。見表1。

表1　各組Morris水迷宮實驗數據比較

組別逃避潛伏期時間(秒) 第1d 第2d 第3d 第4d穿越目標次數(次)NS40.30±6.1332.54±5.4027.05±4.1620.66±3.215.31±0.84LEV39.89±5.5733.56±4.6229.55±4.0620.09±2.735.16±0.81Li-pllo50.76±5.52ab48.28±4.41ab46.21±4.33ab37.10±3.38ab2.68±0.35abLi-pllo+LEV45.64±5.96abc40.02±4.39abc37.25±4.27abc28.22±3.48abc4.28±0.41abcF值8.59518.91038.05149.96529.128P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

注：a與NS組比較，P<0.05；b與LEV組比較，P<0.05；c與Li-pllo組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠海馬組織中μ-calpain的表達

與NS組相比，LEV組的μ-calpain的表達無顯著變化 (P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的μ-calpain的表達則顯著下降(P<0.05)，但未恢復到正常水平。見表2。

表2　各組大鼠海馬組織中μ-calpain的表達(個/高倍視野)

注：a與NS組比較，P<0.05；b與LEV組比較，P<0.05；c與Li-pllo組比較，P<0.05。

2.3各組大鼠海馬組織中caspase-3的表達

與NS組相比，LEV組的caspase-3的表達無顯著變化 (P>0.05)；而與Li-pllo組相比，Li-pllo+LEV組的caspase-3的表達則顯著下降(P<0.05)，但未恢復到正常水平。見表3。

表3　各組大鼠海馬組織中caspase-3的表達(個/高倍視野)

注：a與NS組比較，P<0.05；b與LEV組比較，P<0.05；c與Li-pllo組比較，P<0.05。

3　討論

長期頻繁的癲癇發作不僅可導致患者的智力及認知功能嚴重受損，更會對精神造成嚴重影響，最后逐漸喪失工作能力甚至生活能力,甚至危及生命。LEV自上市以來在治療兒童癲癇方面已表現出耐受性好、與其他AEDs藥物相互作用少以及對認知功能影響小等優勢[6，7]。王樹華等[8]在研究中發現，神經元出現變性、死亡和細胞結構瓦解現象。而μ-calpain和caspase-3都參與了癲癇大鼠海馬神經元損傷過程。Calpain廣泛存在于神經細胞內。而caspases在細胞凋亡的發生發展過程中處于中心地位。有資料顯示，在由癲癇引起海馬神經元丟失中，caspase-3發揮了重要的作用[9，10]。本研究結果反映了大鼠空間學習及記憶能力和μ-calpain及caspase-3的改變存在密切聯系。與NS組相比，LEV 對照組的μ-calpain和caspase-3的表達量和 Morris 水迷宮測試結果全部無明顯差異；Li-pilo組的μ-calpain和caspase-3的表達量明顯升高，Morris 水迷宮測試也顯示其空間學習及記憶能力較差；經 LEV 治療后，Li-pilo+LEV組μ-calpain和caspase-3的表達量明顯降低，逃避潛伏期短，空間搜索能力強。提示LEV 對癲癇大鼠空間學習及記憶能力無損害作用。LEV 可以改善癲癇大鼠的空間學習及記憶，記憶貯存及再現能力。它能使癲癇大鼠的逃避潛伏期縮短，而空間搜索能力增強。并且LEV的這種作用可能是通過減低癲癇大鼠海馬組織中μ-calpain和caspase-3蛋白的表達實現的。這將為臨床應用LEV治療癲癇提供更有效的理論依據。

[1]Trojnar MK, Maek R, Chrocińska M, et al. Neuroprotective effects of antiepileptic drugs[J].Pol J Pharmacol,2002,54(6):557-566

[2]王海燕,王影,聶磊,等.左乙拉西坦對癲癇大鼠認知功能及海馬組織中NPY和NCAM-mRNA表達的影響[J].黑龍江醫藥科學,2013,36(3):3-5

[3]張巖,王海燕,王影,等.左乙拉西坦對癲癇大鼠認知功能的影響研究 [J].黑龍江醫藥科學,2013,36(2):6-8

[4]陳子怡, 陳樹達, 周玨倩, 等. 匹羅卡品誘發癲癇持續狀態大鼠模型的改良和鑒定[J]. 解剖學研究, 2011,33(2):131-149

[5]Racine RJ. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure[J]. Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1972,32(3):281-294

[6]Briggs DE1, French JA. Levetiracetam safety profiles and tolerability in epilepsy patients[J]. Expert Opin Drug Saf，2004，3(5):415-424

[7]Grosso S, Franzoni E, Coppola G, et al. Efficacy and safety of levetiracetam: an add-on trial in children with refractoryepilepsy[J].Seizure, 2005,14(4):248-253

[8]王樹華. 癲癇持續狀態大鼠海馬神經元程序性死亡與μ-calpain相關機制的實驗研究[D]. 山東:山東大學,2008

[9]Henshall DC, Chen J, Simon RP. Involvement of caspase-3-like protease in the mechanism of cell death following focally evokedlimbic seizures[J].J Neurochem,2000,74(3):1215-1223

[10]Kondratyev A, Gale K. Intracerebral injection of caspase-3 inhibitor prevents neuronal apoptosis after kainic acid-evoked status epilepticus[J].Brain Res Mol Brain Res,2000,75(2):216-224

中圖分類號：R742.1

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2015)06-0061-03

作者簡介：①韓麗萍(1979~) 女，黑龍江牡丹江人，學士，主治醫師。

通訊作者：鄒艷紅(1978~)女，黑龍江佳木斯人，碩士, 主治醫師。E-mail：25582393@qq.com。

(收稿日期：2015-03-17)