糖尿病患者IRS-1和MTHFR基因多態(tài)性分析①

王　歆，方　舟，方　芳，沈德鳳，荊洪英

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154003)

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糖尿病患者IRS-1和MTHFR基因多態(tài)性分析①

王歆1，方舟2，方芳2，沈德鳳1，荊洪英2

(1.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通過比較本地區(qū)健康人與糖尿病患者IRS-1和MTHFR基因多態(tài)性的差異，探索IRS-1和MTHFR基因多態(tài)性與糖尿病發(fā)病的關(guān)系。方法：采用熒光原位雜交法檢測(cè)健康人和糖尿病患者IRS-1和MTHFR的基因型分布，通過χ2檢驗(yàn)來比較健康人和糖尿病患者的基因型分布的差異。結(jié)果：健康人和糖尿病患者的IRS-1基因型分布差異沒有顯著性差異(P>0.05)；健康人和糖尿病患者的MTHFR基因型分布有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論：糖尿病的發(fā)生與MTHFR的堿基變異具有相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：IRS-1；MTHFR；基因多態(tài)性；熒光原位雜交；糖尿病

在糖尿病因與治療的探討中，基因多態(tài)性對(duì)2型糖尿病形成與治療是目前醫(yī)務(wù)工作者關(guān)心的課題之一。IRS-1是首先發(fā)現(xiàn)的胰島素受體底物, 它作為調(diào)節(jié)B細(xì)胞功能的重要信號(hào)分子,主要調(diào)節(jié)胰島素分泌。它在胰島素作用的外周組織如骨骼肌、脂肪、肝臟等均有分布,但主要在骨骼肌表達(dá)。IRS-1抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子ATP酶,使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高,從而激活蛋白激酶C,刺激胰島素釋放[1]。研究表明，IRS-1基因存在多種多態(tài)性,其中部分與糖尿病或胰島素抵抗有關(guān)。

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase gene MTHFR)MTHFR C677T 基因突變是目前發(fā)現(xiàn)的 MTHFR 基因最常見的不耐熱錯(cuò)義突變，MTHFR基因的677位堿基胞嘧啶(Cytosine, C)被胸腺嘧啶(Thymine,T)置換，使編碼的丙氨酸(Ala)變異為纈氨酸(Val)而產(chǎn)生多態(tài)性[2~4]。MTHFR基因位于染色體1q36.3，編碼區(qū)長(zhǎng)1980bp， MTHFR C677T 具有相對(duì)較高的突變頻率，MTHFR基因突變是心血管病變的危險(xiǎn)因素，尤其在糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病中，MTHFR基因突變率明顯高于對(duì)照組[5]。本研究對(duì) IRS-1基因和MTHFR基因單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析，探索IRS-1 SNP rs2943650，MTHFR SNP rs1801133與糖尿病的相關(guān)性，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取2014-06~2015-06住院的2型糖尿病患者108例，健康人90例，糖尿病診斷依據(jù)WHO1998年新的診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除1型糖尿病、妊娠型糖尿病和特殊類型糖尿病，見表1。

儀器和試劑有 TL-988實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：西安天隆科技儀器有限公司；熒光原位雜交DNA測(cè)序分析程序：北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司；掌式離心機(jī)：珠海博邁杰生物科技有限公司；HC-3017高速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；PHARM-GENE 01 SNP分析保存液，PHARM-GENE 200 SNP分析樣品處理試劑(北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司)。

表1　糖尿病組與對(duì)照組一般資料

1.2方法

1.2.1基因多態(tài)性檢測(cè)方法

取150μL新鮮全血加入含有1000μL氯化銨溶液的Eppendorf 管中，混合混勻后室溫放置5min，3000r/min(700g)離心5min，用移液器吸出上清液。在富集了白細(xì)胞的管中加入100μL耀金保，震蕩混合混勻，室溫放置20~30min。吸取本液1.0~1.5μL加入待測(cè)基因?qū)?yīng)的耀金分試劑中，漩渦混合均勻，瞬時(shí)離心，上至機(jī)器中檢測(cè)；檢測(cè)條件：95℃預(yù)變性600s；95℃變性30s，62℃復(fù)性75s，45或50個(gè)循環(huán)。在樣品檢測(cè)的同時(shí)，加測(cè)3種不同基因型的質(zhì)控品作為對(duì)照。

1.2.2基因型的判斷

當(dāng)一條基因熒光曲線值高于另一條基因熒光曲線，且兩條曲線的St差值比雜合子要大，或者其中一條曲線的St值為-1，根據(jù)曲線顏色判斷為野生或突變純合子。當(dāng)兩條熒光曲線幾乎同時(shí)升起，且趨勢(shì)大致相同，達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間也相近，兩條曲線St值等于或小于質(zhì)控品的雜合子St值之差，判斷為雜合子。并將檢測(cè)的樣品熒光曲線圖與質(zhì)控品曲線圖進(jìn)行比較。

IRS 1 SNP rs2943650熒光擬合曲線如圖1；MTHFR SNP rs1801133熒光擬合曲線如圖2。

圖1　IRS 1 SNP rs2943650(C>T)熒光擬合曲線

圖2　MTHFR SNP rs1801133(C>T)熒光擬合曲線

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)來計(jì)算糖尿病組和健康人組的三種基因型的分布頻率，P<0.05為差異具有顯著性。

2　結(jié)果

分別檢測(cè)IRS-1 SNP rs2943650，MTHFR SNP rs1801133基因多態(tài)性，計(jì)算各基因型的分布頻率，見表2~3。

表2　IRS-1 SNP rs2943650基因多態(tài)性與糖尿病的關(guān)系(%)

由表2看出，兩組rs2943650三種基因型頻率的分布沒有顯著性差異(P>0.05)。

表3　MTHFR SNP rs1801133基因多態(tài)性與胰島素抵抗的關(guān)系(%)

由表3可見，兩組rs1801133三種基因型頻率的分布有顯著性差異(P<0.05)。

3　討論

熒光原位雜交法檢測(cè)技術(shù)快捷、準(zhǔn)確，適用于醫(yī)院對(duì)患者基因型的檢測(cè)。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，一些藥物相關(guān)基因多態(tài)性與疾病的相關(guān)性研究越來越受關(guān)注[6~9]，為臨床疾病的診斷和治療提供了依據(jù)。IRS-1 基因是引起胰島素抵抗的重要基因，IRS-1是位于胰島素級(jí)聯(lián)信號(hào)上的第一個(gè)受體底物，該基因位于染色體 2q36-37，其編碼產(chǎn)物 IRS-1 是分布于胰島素敏感組織內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。當(dāng)IRS-1 出現(xiàn)異常時(shí)，胰島素信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生改變，影響機(jī)體對(duì)胰島素的利用，就會(huì)產(chǎn)生胰島素抵抗[10]。近年的研究結(jié)果顯示，同型半胱氨酸(homocysteine,Hey)不僅與2 型糖尿病發(fā)病有相，還與其血管、神經(jīng)等并發(fā)癥密切相關(guān)，糖尿病患者血清Hcy水平如高于正常人，就有增加主動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)和易產(chǎn)生胰島素抵抗[11]。Frosst等發(fā)現(xiàn)MTHFR rs1801133位點(diǎn)不易受外界環(huán)境影響而發(fā)生突變[12]，可能會(huì)造成 MTHFR 活性降低而導(dǎo)致同型半胱氨酸的甲基化紊亂，引起高同型半胱氨酸血癥。因此，MTHFR 基因突變可能是 2 型糖尿病發(fā)病的一個(gè)危險(xiǎn)因素。

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中圖分類號(hào)：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0046-02

基金項(xiàng)目：①佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)面上項(xiàng)目，編號(hào)：S2014-031。

作者簡(jiǎn)介：王歆(1988～)女，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

通訊作者：荊洪英(1965～)女，黑龍江雞西人，學(xué)士，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:fangzhou84@163.com。

(收稿日期：2015-06-15)