山楂葉總黃酮治療大鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用的分子機(jī)制研究①

高英英，辛　華，孫玉鴻，趙　婧，馬　雷

(1.佳木斯大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

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山楂葉總黃酮治療大鼠動(dòng)脈粥樣硬化作用的分子機(jī)制研究①

高英英1，辛華2，孫玉鴻2，趙婧1，馬雷2

(1.佳木斯大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：以山楂葉總黃酮為主要藥物治療AS大鼠，以此研究該病的分子機(jī)制，為臨床尋找治療AS的新途徑。方法：以AS造模大鼠為研究對(duì)象，通過(guò)自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清血脂四項(xiàng)，ELISA法檢測(cè)外周血血清MCP-1、MMP-9和TIMP-1三種蛋白含量，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)這三種蛋白mRNA的表達(dá)量。結(jié)果：形態(tài)學(xué)觀察大鼠造模成功，模型組與正常對(duì)照組比較，血脂四項(xiàng)有顯著性差異，血清中MCP-1、MMP-9和TIMP-1三種蛋白含量明顯升高，其mRNA表達(dá)水平顯著升高。山楂葉總黃酮治療組與模型組比較，MCP-1和MMP-9含量顯著降低，TIMP-1含量顯著升高，其mRNA表達(dá)量也呈相應(yīng)改變，呈一定的劑量相關(guān)性。結(jié)論：山楂葉總黃酮在治療和預(yù)防AS中起到了阻止早期發(fā)生，扭轉(zhuǎn)病情，減緩發(fā)展的作用，為臨床提供了一種較好的中藥治療選擇。

關(guān)鍵詞：山楂葉總黃酮；MCP-1；MMP-9；TIMP-1

動(dòng)脈粥樣硬化 (atherosclerosis，AS)是多種心腦血管疾病的首要病理因素，在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，病死率一直居首位。在我國(guó)，由于人民的生活水平的提高和生活習(xí)慣的變化，AS的發(fā)病率較已往明顯的增高。有研究表明，AS的形成過(guò)程主要依賴于動(dòng)脈血管內(nèi)膜的破損，進(jìn)而引起外周血液循環(huán)中的單核細(xì)胞吸附，最后形成吞噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)變?yōu)閿z取脂肪的泡沫細(xì)胞[1]。所以，研究AS形成過(guò)程中炎癥相關(guān)因素的發(fā)病機(jī)制，尋找緩解并治療AS的藥物至關(guān)重要。本課題組以中草藥山楂葉總黃酮為主要藥物治療造模大鼠AS，從而研究該病的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，以期為臨床提供一個(gè)治療AS的新方法。

1　資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取大鼠50只，來(lái)自佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，平均體重(235±30)g，隨機(jī)分為5組，每組10只。設(shè)立正常對(duì)照組、模型組、山楂葉總黃酮大劑量組、中劑量組和小劑量組。

1.1.2藥物和試劑

山楂葉總黃酮選自臨沂愛(ài)康藥業(yè)有限公司 ，批號(hào)AKH010-B，純度為90%。丙基硫氧嘧啶為上海復(fù)星朝暉，批號(hào)091209。RT-PCR試劑盒選自大連寶生物工程有限公司，血脂四項(xiàng)檢測(cè)試劑盒選自南京建成生物工程研究所，ELISA血清蛋白檢測(cè)試劑盒選自上海西唐生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器

基因擴(kuò)增儀Biometre公司，DYC-33B型水平電泳槽北京八一儀器廠，凝膠成像處理系統(tǒng)上海天能科技有限公司，ZF-90型暗箱式紫外透射儀上海顧村電光儀器廠，光學(xué)顯微鏡OlympusX51，生化分析儀BECKMANAU5800，DNM9602G型酶標(biāo)儀北京普朗技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1造模及給藥

正常對(duì)照組給予正常顆粒飼料，正常顆粒飼料的主要成分和比例：玉米：55%；豆粕：22%；麥麩：16%；魚(yú)粉：5%；氨基酸：1%食鹽：0.9%；微量元素：0.1%；以上均由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。模型組和給藥組給予高脂飼料和按照60萬(wàn)單位/kg體重一次性腹腔注射維生素D3。高脂飼料的主要成分是在正常顆粒飼料的基礎(chǔ)上添加膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶、白糖和豬油[2]，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心負(fù)責(zé)壓制成顆粒飼料。

喂養(yǎng)4周后，球后靜脈取血，測(cè)定血脂四項(xiàng)，評(píng)價(jià)造模是否成功。從第5周開(kāi)始，給藥組每天一次灌胃給藥，給予山楂葉總黃酮的劑量為大劑量組按照250mg/kg，中劑量組為125mg/kg，小劑量為62.5mg/kg。同時(shí)模型組給予250mg/kg的生理鹽水。第8周結(jié)束時(shí)，采用斷尾取血法，留取血液，低速離心，吸取血清置-20℃冷凍備用。處死大鼠后仔細(xì)挑取主動(dòng)脈弓與胸主動(dòng)脈交界處血管，清洗血跡后，部分保存在10%酸性甲醛中，其余標(biāo)本保存在液氮罐中備用。

1.2.2顯微鏡觀察動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)

將甲醛固定的血管標(biāo)本送往佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，通過(guò)HE染色后觀察動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)。

1.2.3血清血脂四項(xiàng)檢測(cè)

將留取的血清標(biāo)本送往佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科生化室，由專業(yè)人員嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)要求，檢測(cè)總膽固醇(Total cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(High density cholesterol, HDL-C)及TC/HDL-C。

1.2.4 ELISA檢測(cè)三種蛋白

將留取的血清標(biāo)本送往佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科免疫室，由專業(yè)人員嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)要求，檢測(cè)血清中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of matrix metalloprotein-1 ,TIMP-1)三種蛋白的含量。

1.2.5PR-PCR基因檢測(cè)

將液氮保存的動(dòng)脈組織精確稱取1g，嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)要求檢測(cè)MCP- mRNA 1，MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA三種基因的表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1顯微鏡觀察動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)

對(duì)照組:肉眼可見(jiàn)大鼠主動(dòng)脈血管壁內(nèi)膜光滑。鏡下觀察可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞完整，內(nèi)皮細(xì)胞連接緊密，中膜層平滑肌細(xì)胞厚度均勻一致，成梭型排列整齊。模型組: 肉眼可見(jiàn)大鼠主動(dòng)脈血管有少量黃色的脂樣斑塊并向管腔內(nèi)凸起，主要分布在近主動(dòng)脈弓處，嚴(yán)重者可覆蓋整個(gè)血管內(nèi)膜。鏡檢可見(jiàn)內(nèi)膜細(xì)胞體積增大，部分有脫落現(xiàn)象，內(nèi)皮細(xì)胞之間間隙增寬，其表面有較多的單核細(xì)胞侵潤(rùn)，可見(jiàn)大量巨噬細(xì)胞和脂肪空泡，說(shuō)明大鼠AS模型造模成功。大劑量組：肉眼可見(jiàn)有少量黃色的脂樣斑塊并凸向管腔，病變表現(xiàn)與模型組相似，但是病變程度較輕，鏡下觀察可見(jiàn)內(nèi)膜尚完整且較平坦，與模型組比較，其內(nèi)膜增厚的程度及黏附并浸潤(rùn)于內(nèi)膜下的單核細(xì)胞均明顯減少。小劑量組：肉眼可見(jiàn)少量脂樣斑塊，鏡檢可見(jiàn)內(nèi)膜細(xì)胞體積較大，內(nèi)皮細(xì)胞之間間隙較寬，含有較多的單核細(xì)胞侵潤(rùn)，含有少量的脂肪空泡。中劑量組：形態(tài)結(jié)構(gòu)介于大、小劑量組之間。

2.2山楂葉總黃酮和各組血清血脂四項(xiàng)水平的關(guān)系

模型組與對(duì)照組比較， TC、LDL-C和TC/HDL-C都由顯著性差異(P<0.01)，TG差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),HDL-C差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥組與模型組比較，其中，大劑量組TG、TC、HDL-C和LDL-C差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中TC/HDL-C有顯著性差異(P<0.01)。中劑量組與模型組比較，只有HDL-C一個(gè)指標(biāo)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小劑量組與模型組比較，只有TC/HDL-C有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　山楂葉總黃酮和各組血清血脂四項(xiàng)水平的關(guān)系±s，n=10)

組別TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TC/HDL-C對(duì)照組0.98±0.042.79±0.051.11±0.081.48±0.052.60±0.04模型組1.49±0.01*4.85±0.03**1.06±0.052.89±0.04**4.40±0.04**大劑量組1.06±0.07#4.01±0.03#1.59±0.05#1.78±0.06#2.39±0.02##中劑量組1.25±0.03#3.63±0.05#1.24±0.071.72±0.08#2.46±0.06##小劑量組1.38±0.042.891±0.071.12±0.081.53±0.052.50±0.04#

注：與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01；與AS模型組比較#P<0.05,##P<0.01。

2.3山楂葉總黃酮與外周血MCP-1、MMP-9、TIMP-1三種蛋白含量的關(guān)系

模型組和給藥組與正常組比較，三種蛋白和MMP-9/TIMP-1四個(gè)指標(biāo)均有顯著性差異(P<0.01)。給藥組與模型組比較，大劑量組三種蛋白和MMP-9/TIMP-1四個(gè)指標(biāo)均有顯著性差異(P<0.01)。中劑量組MMP-9、TIMP-1和MMP-9/TIMP-1三個(gè)指標(biāo)有顯著性差異(P<0.01)。小劑量組只有MMP-9/TIMP-1有顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2　山楂葉總黃酮與外周血MCP-1、MMP-9、TIMP-1三種蛋白含量的關(guān)系

組別MCP-1(pg/mL)MMP-9(ng/mL)TIMP-1(ng/mL)MMP-9/TIMP-1對(duì)照組90.32±7.69160.89±6.8370.12±8.972.21±0.15模型組256.33±11.84*339.62±10.71*89.66±9.15*3.65±0.17*大劑量組179.63±10.21*#281.55±8.02*#120.61±8.54*#2.30±0.15*#中劑量組213.12±10.05*297.03±10.64*#109.66±9.17*#2.90±0.21*#小劑量組229.44±7.85*325.66±10.92*98.92±9.32*3.21±0.12*#

注：與對(duì)照組比較*P<0.01；與AS模型組比較#P<0.01。

2.4山楂葉總黃酮和動(dòng)脈組織三種蛋白mRNA及MMP-9/TIMP-1相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系

模型組和給藥組與正常組比較，三種蛋白mRNA和MMP-9/TIMP-1四個(gè)指標(biāo)均有顯著性差異(P<0.01)。給藥組與模型組比較，大劑量組三種蛋白mRNA和MMP-9/TIMP-1四個(gè)指標(biāo)均有顯著性差異(P<0.01)，中劑量組MMP-9和MMP-9/TIMP-1兩個(gè)指標(biāo)有顯著性差異(P<0.01)，小劑量組只有MMP-9/TIMP-1有顯著性差異(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3　山楂葉總黃酮和動(dòng)脈組織三種蛋白mRNA及MMP-9/TIMP-1相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系±s)

組別MCP-1mRNAMMP-9mRNATIMP-1mRNAMMP-9/TIMP-1對(duì)照組0.38±0.060.45±0.030.50±0.060.79±0.04模型組1.03±0.05*1.01±0.06*0.66±0.05*1.50±0.05*大劑量組0.56±0.04*#0.80±0.05*#0.89±0.06*#0.89±0.07*#中劑量組0.69±0.06*0.88±0.06*#0.82±0.05*1.10±0.06*#小劑量組0.84±0.11*0.96±0.05*0.78±0.04*1.30±0.07*#

注：與對(duì)照組比較*P<0.01；與AS模型組比較#P<0.01。

3　討論

近年來(lái)，由于AS致死人數(shù)已過(guò)半數(shù)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)腫瘤。AS主要侵害循環(huán)系統(tǒng)中主動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈等大、中動(dòng)脈。1999年，Ross等明確提出作為一種炎癥疾病，AS具有變質(zhì)、滲出、增生等病理特征，而且其發(fā)展也始終伴隨慢性炎癥反應(yīng)過(guò)程[3，4]。AS的大量研究中顯示[5～7]，高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥是AS病變的始動(dòng)環(huán)節(jié)。本課題模型組與正常組比較，大鼠的TC、LDL-C和TC/HDL-C都由顯著性差異，TG差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明TC、LDL-C和TG含量與冠心病發(fā)病率明顯相關(guān)。而山楂葉總黃酮給藥組這三個(gè)指標(biāo)明顯下降，呈劑量依賴性，大劑量組HDL-C顯著升高，表明山楂葉總黃酮可能通過(guò)影響大鼠血脂的方式來(lái)治療AS。MCP-1對(duì)單核細(xì)胞具有非常強(qiáng)大的誘導(dǎo)作用，促使單核細(xì)胞在AS的早期進(jìn)入血管內(nèi)膜，在大鼠AS模型組的血清中和動(dòng)脈組織中我們都檢測(cè)到大量的MCP-1蛋白和mRNA，同正常組比較，具有顯著性差異。正常情況下MMP-9和TIMP-1在動(dòng)脈壁處于一種動(dòng)態(tài)的平衡，二者相互影響制約，當(dāng)發(fā)生AS時(shí)這種平衡被打亂[8]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AS模型組大鼠血清及動(dòng)脈組織中的MMP-9和TIMP-1兩種蛋白和其mRNA水平明顯高于正常對(duì)照組。然而TIMP-1增高的幅度沒(méi)有 MMP-9顯著，從而使得MMP-9/TIMP-1明顯的升高，說(shuō)明AS纖維帽膠原的消融超過(guò)了產(chǎn)生，導(dǎo)致了AS結(jié)構(gòu)的的破壞，引起AS斑塊的破裂。試驗(yàn)結(jié)果表明山楂葉總黃酮治療的大鼠的動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)較模型組顯著好轉(zhuǎn)，各治療組的血清MCP-1和MMP-9蛋白水平和動(dòng)脈組織中的mRNA表達(dá)量都較模型組減低，而TIMP-1水平較模型組升高，致使MMP-9/TIMP-1比值顯著減低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，山楂葉總黃酮在治療和預(yù)防AS中起到了阻止早期發(fā)生，扭轉(zhuǎn)病情，減緩發(fā)展的作用，為臨床治療AS提供了一種較好的中藥治療選擇。

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中圖分類(lèi)號(hào)：R285.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2015)06-0035-03

基金項(xiàng)目:①1.黑龍江省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目,編號(hào)：ZHY12-Z200；2.黑龍江衛(wèi)生廳科研課題，編號(hào)：2012-242；3.佳木斯大學(xué)科研項(xiàng)目，編號(hào)：S2010-104。

作者簡(jiǎn)介:高英英(1980～)女,黑龍江雞西人,碩士,講師。

通訊作者:馬雷(1980～)男,黑龍江哈爾濱人,碩士,主管技師。E-mail:maleijms@163.com。

(收稿日期：2015-04-30)