Slc25a3基因在低硒大鼠心肌細胞內的表達①

初而復,屈瑋婷,李　欣,張明亮,盧均坤

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003；2.齊齊哈爾建華醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

?

Slc25a3基因在低硒大鼠心肌細胞內的表達①

初而復1,屈瑋婷2,李欣1,張明亮1,盧均坤1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003；2.齊齊哈爾建華醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

摘要:目的:探討低硒狀態下SD大鼠心肌細胞內Slc25a3基因的表達情況。方法:將24只正常成年雄性SD大鼠隨機等分為低硒組和正常組。兩組大鼠分別給予低硒飲食及正常飲食。飼養4周后，進行動物模型鑒定實驗。采用熒光法檢測兩組大鼠主要臟器的硒含量、采用谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒檢測肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx-1)的活性、采用Real-time PCR方法檢測GPx-1的mRNA水平的相對表達、采用丙二醛(MDA)測定試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)測試盒檢測兩組動物模型主要臟器中MDA含量和SOD活性；8周后，脊髓離斷處死全部大鼠，取心臟組織進行下一步實驗。結果:低硒組大鼠體內主要臟器硒含量均明顯低于對照組，氧化應激水平明顯高于對照組，心肌細胞內Slc25a3基因相對表達量明顯高于對照組。結論:硒元素缺乏可以導致大鼠心肌細胞內Slc25a3基因相對表達量明顯升高。

關鍵詞：低硒；大鼠；MPTP；氧化應激；Slc25a3基因

線粒體是細胞物質與能量代謝的重要場所，它能通過電子傳遞鏈的氧化磷酸化反應為有機體提供90%的ATP能源，維持機體的各項生理機能[1]。線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)大量開放是導致線粒體功能障礙的關鍵[2]。PiC是位于線粒體內膜上的一種重要的功能蛋白，其功能主要是使重要的代謝底物：無機磷酸(Pi)從細胞質轉移到線粒體基質[3]。研究表明，PiC可以在MPTP開放中發揮重要作用[4]。PiC由多種編碼基因共同調控，其中Slc25a3基因是編碼PiC基因的重要組成部分，研究發現PiC的表達量與Slc25a3的表達情況密切相關[5]。

微量元素硒(selenium, Se)是哺乳動物體內的一種必需微量元素，在機體內許多生物學過程中都發揮著重要功能。研究證實，硒元素缺乏可以導致心血管、內分泌、生殖等多個系統功能發生異常，與很多疾病的發生及發展有密切的關系[6]。但硒元素缺乏是否可以導致心肌細胞內能量代謝發生異常改變，尚未見報道。本研究通過構建低硒動物模型，對低硒大鼠心肌細胞內Pic基因的表達情況進行研究，從而揭示了低硒狀態下，大鼠心肌細胞能量代謝變化的可能途徑。

1　材料與方法

1.1實驗動物及飼料

正常成年雄性SD大鼠24 只，體重180~220g，均購買自哈爾濱醫科大學實驗動物中心；正常飼料，購買自佳木斯大學實驗動物中心；自制低硒飼料，以低硒酵母為主要原料，同時加入蔗糖、各種維生素以及除硒元素以外的各種微量元素配制而成的粉末狀飼料。

1.2實驗試劑

谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒(南京碧云天，中國)，超氧化物歧化酶檢測試劑盒(南京碧云天，中國)，丙二醛檢測試劑盒(南京碧云天，中國)，Trizol(Invitrogen，美國)，DEPC(Sigma，美國)，ABI SybrGreen PCR Master Mix(ABI，美國)，引物(上海生工公司，中國)，抗體(Santa, 美國)。

1.3動物模型建立

兩組實驗動物均在清潔級動物室中進行飼養。將24 只正常成年雄性SD大鼠隨機等分為低硒組和正常組。低硒組給予自制低硒飼料及去離子水喂養，正常組給予正常飼料及高溫滅菌后的自來水喂養。飼養4 周后，隨機選取兩組各6 只大鼠確定低硒動物模型建立是否成功。脊髓離斷處死大鼠，分別取心臟、肝臟、腎臟組織以及采集下腔靜脈中靜脈血液，采用熒光法檢測兩組大鼠主要臟器的硒含量、采用谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)試劑盒檢測肝臟中GPx-1的活性[7]、采用Real-time PCR檢測GPx-1的mRNA表達情況、采用丙二醛(MDA)測定試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)測試盒檢測兩組大鼠主要臟器的MDA含量[8]和SOD活性[9]；8周后，剩余全部大鼠采用脊髓離斷的方法處死，取心臟組織進行下一步實驗。本實驗嚴格遵循《實驗動物保護條例》。

1.4低硒動物模型鑒定

取適量組織樣本在冰浴下用勻漿器勻漿，用生理鹽水制成10%的組織勻漿，4℃ 3000rpm離心10min，取上清液檢測。嚴格按照試劑盒說明，檢測兩組大鼠主要臟器內硒含量，兩組大鼠肝臟組織內GPx-1活性及其mRNA表達情況，同時檢測兩組大鼠各臟器SOD活力及MDA含量，所有操作步驟均嚴格按照說明書進行。

1.5Real-time PCR檢測PiC基因的表達

心臟組織RNA提取采用Trizol試劑提取方法。采用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒于PCR反應擴增儀(ABI，美國)上將提取的總RNA逆轉錄為cDNA。Real-time PCR 采用ABI SybrGreen PCR試劑盒說明書在20 μL反應體系中進行PCR擴增。采用Livak法即2-(ΔΔCt)法對PCR的數據進行分析，上述實驗重復三次。本實驗中的引物序列均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.6統計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行數據統計，各組間的數據比較采用t檢驗分析，以P<0.05為有顯著性差異。

2　結果

2.1兩組大鼠肝臟、心臟、腎臟及靜脈血液硒含量檢測

結果顯示，低硒組大鼠的肝臟、心臟、腎臟以及靜脈血液的硒含量均明顯低于正常組(*P<0.01)。我們發現，低硒組大鼠的肝臟硒含量為正對照組的36.13 %(A)，心臟硒含量為正常組的56.42 %(B)，腎臟硒含量為對照組的34.88 %(C)，靜脈血液硒含量為對照組的37.05 %(D),見圖1。

圖1　兩組大鼠肝臟(A)、心臟(B)、腎臟(C)及靜脈血液(D)硒含量檢測

2.2兩組大鼠肝臟GPx-1活性及其mRNA表達

結果顯示，低硒組大鼠肝臟內GPx-1的活性及其mRNA表達水平均明顯低于對照組(*P<0.01)。通過對低硒組大鼠肝臟中含硒蛋白GPx活性的檢測說明低硒組大鼠體內硒含量的缺乏，導致了含硒蛋白活性的減低，而GPx-1基因mRNA表達下調也進一步證明了低硒動物模型建立成功，見圖2。

圖2　母體SD大鼠肝臟GPx-1活性

2.3兩組大鼠MDA含量與SOD活性的測定

結果顯示，低硒組大鼠主要臟器MDA含量明顯高于對照組(A)，而SOD活性低于對照組(B)(*P<0.01)。結果表明，低硒組大鼠處于高氧化應激狀態。研究證實哺乳動物體內硒元素缺乏可以使機體處于高氧化應激狀態，因此本結果間接證明低硒動物模型建立成功[14]，見圖3。

圖3　兩組大鼠各臟器MDA含量(A)及SOD活力(B)檢測

2.4Real-time PCR技術檢測Slc25a3基因的表達

結果顯示，低硒組大鼠心肌細胞內Slc25a3基因相對表達量明顯高于對照組，差異具有統計學意義(*P<0.05)，見圖4。

圖4　兩組大鼠心肌細胞內Slc25a3基因的表達

3　討論

微量元素硒是機體的一種必需微量元素，在許多生物學過程中發揮著重要功能。硒的生物學作用主要是通過硒蛋白來體現的。機體要不斷攝入外源硒來維持體內硒平衡。因此當食物或飼料中硒含量降低，生物就會處于全身硒水平較低的狀態。MPTP大量開放是導致線粒體功能障礙的關鍵，而PiC是構成MPTP的關鍵性線粒體內膜成分。研究證實肌間纖維線粒體Slc25a3合成顯著減少，ATP合成也顯著減少，隨著線粒體蛋白組學異常，心臟功能失調[10]。本研究通過建立低硒SD大鼠模型，對低硒大鼠心肌細胞內Pic基因的表達情況進行研究，從而揭示了低硒狀態下，大鼠心肌細胞能量代謝變化的可能途徑。研究表明，PiC是構成MPTP的關鍵性成分，心肌細胞內氧化應激水平的改變是影響PiC基因表達的一個重要因素，因此PiC的顯著升高可以導致MPTP的大量開放，從而引起線粒體功能出現異常[11]。本實驗通過對低硒和正常兩種狀態下，大鼠心肌細胞內PiC基因的表達情況進行對比，旨在揭示硒元素在哺乳動物心肌細胞內可以發揮重要作用，缺乏硒元素可導致心肌細胞能量代謝發生明顯改變，為下一步的人體研究提供了基礎研究的實驗依據。

參考文獻：

[1]Wided K, Hassiba R, Mesbah L. Polyphenolic fraction of Algerian propolis reverses doxorubicin induced oxidative stress in liver cells and mitochondria [J]. Pak J Pharm Sci，2014，27(6):1891-1897

[2]Ascenso A, Lumini-Oliveira J, Machado NG, et al. Acute exercise protects against calcium-induced cardiac mitochondrial permeability transition pore opening in doxorubicin-treated rats [J]. Clin Sci (Lond)，2011，120(1): 37-49

[3]盧均坤，苗秋實，呂維娟，等.姜黃素對阿霉素所致大鼠急性心肌損傷的保護作用[J]. 黑龍江醫藥科學，2013，36(5):5-7

[4]Varanyuwatana P, Halestrap AP. The roles of phosphate and the phosphate carrier in the mitochondrial permeability transition pore [J]. Mitochondrion，2012，12(1):120-125

[5]Bhoj EJ, Li M, Ahrens-Nicklas R, et al. Pathologic Variants of the Mitochondrial Phosphate Carrier SLC25A3: Two New Patients and Expansion of the Cardiomyopathy/Skeletal Myopathy Phenotype With and Without Lactic Acidosis [J]. JIMD Rep，2015：15

[6]Kalishwaralal K, Jeyabharathi S, Sundar K,et al. Sodium selenite/selenium nanoparticles (SeNPs) protect cardiomyoblasts and zebrafish embryos against ethanol induced oxidative stress[J]. J Trace Elem Med Biol，2015，32:135-44

[7]Ruseva B, Atanasova M, Georgieva M,et al. Effects of selenium on the vessel walls and anti-elastin antibodies in spontaneously hypertensive rats [J]. Exp Biol Med,2012，237(2):160-166

[8]Zhang ZW, Wang QH, Zhang JL，et al. Effects of Oxidative Stress on Immunosuppression Induced by Selenium Deficiency in Chickens [J]. Biol Trace Elem Res, 2012，149(3):352-361

[9]Erkekoglu P, Giray B, Rachidi W,et al. Effects of di(2-ethylhexyl)phthalate on testicular oxidant/antioxidant status in selenium-deficient and selenium-supplemented rats [J]. Environ Toxicol，2014，29(1):98-107

[10]Baseler WA, Thapa D, Jagannathan R, et al. miR-141 as a regulator of the mitochondrial phosphate carrier (Slc25a3) in the type 1 diabetic heart [J]. Am J Physiol Cell Physiol，2012， 303(12):1244-1251

[11]徐輝, 魏曉東, 歐芹，等.肉蓯蓉不同成分抗衰老作用的研究[J]. 黑龍江醫藥科學, 2011, 34(1): 1-2

中圖分類號：R-332;Q505

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2015)06-0033-02

基金項目：①1.黑龍江省自然科學基金項目，編號：H201365；2.佳木斯大學重點項目，編號：Sz2013-004；3.佳木斯大學研究生科技創新項目，編號：LZZ2015_017。

作者簡介：初而復(1985～)男，山東煙臺人，在讀碩士研究生。

通訊作者：盧均坤(1972～)男，山東日照人，碩士，副教授，副主任醫師，碩士研究生導師。E-mail：ljkuuu@163.com。

(收稿日期：2015-09-16)