腦挫裂傷后水通道蛋白-4與血腦屏障通透性的相關性①

姜廣宇,董　航 ,張文輝, 顧志成,劉勁睿

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

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腦挫裂傷后水通道蛋白-4與血腦屏障通透性的相關性①

姜廣宇,董航 ,張文輝, 顧志成,劉勁睿

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：旨在探討腦挫裂傷急性期水通道蛋白4 (AQP4)在腦水腫發生發展中的作用，了解該病理生理過程中血腦屏障的損傷及通透性增加趨勢，并試圖揭示出其相關性。方法：免疫組化檢測顱內神經組織在腦挫裂傷后AQP4的表達，腦挫裂傷標本來源：36例腦挫裂傷病人急診手術時所獲得的腦挫裂傷灶周圍組織；對照組標本來源：8例原發性癲癇病人，手術時所獲近似正常腦組織，并分析血腦屏障(BBB)指數。結果：腦挫裂傷早期AQP4呈現高表達，且明顯高于對照組(P<0.05)；早期損傷后血腦屏障結構即發生改變，繼之血腦屏障結構明顯的損害，24h、72血腦屏障破壞是最為嚴重。結論：腦挫裂傷后AQP4高表達和BBB損傷導致通透性增加，二者可能存在相關性，對腦水腫而言意義重大。

關鍵詞：水通道蛋白4；腦水腫；血腦屏障；腦挫裂傷

腦水腫是腦挫裂傷后最常見的病理生理過程，研究表明，水通道蛋白在腦水腫過程中擔當重要角色，調節水的跨膜轉運和水平衡[1]。本研究就不同時段腦挫裂傷病人的腦組織中，水通道蛋白4的水平進行測定，同時檢測BBB指數，通過檢測血腦屏障的損傷，提示腦組織損傷程度，試圖探討腦挫裂傷后相關因素對腦水腫發生的作用的理解。

1　資料與方法

1.1一般資料

佳木斯大學附屬第一醫院神經外科入院手術治療的腦挫裂傷病人(2011-01～2012-12)，急診手術時所獲腦挫裂傷組織，單純硬膜外、硬膜下血腫病例未入組，藥物治療方案基本一致。實驗入組病人36例，傷后6～48h，男25例，女11例；年齡25～55歲，平均37.3歲。統計患者顱腦損傷原因:交通事故22例,暴力打擊3例,高空墜落9例,摔倒2例,排除其他系統復合嚴重受傷,減少干擾。術前依據Glasgow評分(GCS)，將此36例腦挫裂傷病人分為3組：輕中型組(GCS：9～15分)11例，重型組(GCS：6～8分)13例，特重型組(GCS：3～5分)15例。并依據創傷后的時間段長短再次分為3組:傷后≤12h組、12～24h組、24～48h組。對照組織來源：8例原發性癲癇病人術中所獲，即相對正常腦組織,男5例,女4例,平均38歲。該實驗經過佳木斯大學附屬第一醫院倫理委員會認證通過。

1.2方法

1.2.1標本處理: 標本經10%甲醛固定48h，再經石蠟包埋，5μm切片備用。

1.2.2電鏡觀察組織超微結構：標本經3%戊二醛溶液固定6h，再經4℃下1%鋨酸固定2h后進行脫水包埋，超薄切片，電鏡觀察。

1.2.3檢測AQP4蛋白表達：依次行石蠟包埋，切片，脫蠟，DAB顯色，蘇木素復染。圖片中免疫組化所示平均灰度定量AQP4蛋白，灰度值高，物質表達含量低，反之亦然。

1.2.4BBB 通透性測定：腦室穿刺或腰椎穿刺后行腦脊液檢查，并對抽取病人靜脈血血清白蛋白進行檢測。樣本來源：病人靜脈血清及腦脊液(CSF)，同時滴定樣本中白蛋白及總蛋白，依據二者含量計算BBB指數，方法依據王擁軍[3]等提出BBB指數計算公式：BBB指數=腦脊液白蛋白(Albcsf)/血清白蛋白(Albs)。

1.3統計學方法

2　結果

2.1超微結構觀察

顯微觀察見對照組微血管內、皮外基底膜完好，內皮細胞無形態異常，無水腫，血-腦屏障結構完整。腦挫裂傷組織的微血管內皮細胞見腫脹變形，血-腦屏障損傷，出現"泡沫"改變。毛細管壁襯砌結構缺陷，并可見內皮細胞間緊密連接受損。神經元及膠質胞體增大，水腫，胞漿增多，胞核固縮，可見染色質崩解，電子密度高 ，見圖1~3。

圖1　對照組腦組織超微結構×10000

圖2　創傷組腦組織超微結構×10000

圖3　血管周圍間隙增寬周邊空泡樣變×10000

2.2AQP4的檢測

腦挫裂傷患者病理，傷后6h即見AQP4表達，統計顯示，傷后≤12h組、12～24h組、24～48h組3個組急性期48h內，時間與AQP4表達呈正相關，其差異有統計學意義(F=3.783，P<0.05)。與此同時，不同程度的腦挫裂傷(特重型，重型，輕中型)，傷情越重，AQP4表達量越高，差異有統計學顯著性(F=3.572，P<0.05)。統計結果提示：48h內，腦挫裂傷嚴重程度與AQP4表達量正相關；傷后時間與AQP4表達正相關，見圖4~5。

圖4　對照組AQP4陽性產物(×200)

圖5　腦挫裂傷周圍AQP4高表達(×200)

≤12h12~24h24~48h輕中型0.183±0.030﹡0.196±0.029﹡0.23±0.022﹡重型0.21±0.021﹡0.232±0.017﹡0.268±0.024﹡特重型0.222±0.040﹡0.242±0.034﹡0.275±0.042﹡對照組0.15±0.0260.15±0.0260.15±0.026

注：觀察組與對照組比較均﹡P<0.05。

2.3BBB通透性檢測

不同組腦挫裂傷BBB指數均增加，12h、24h、48h各時段BBB指數均較對照組明顯升高(P<0.01)，其中24-72h達到高峰(P<0.01)72h后BBB指數開始有所下降;但仍高于對照組 (P<0.01)。

表2　腦挫裂傷后不同時段病人的BBB指數±s)

注：觀察組與對照組比較均﹡P<0.01。

3　討論

水通道蛋白(aquaporin)的發現,提供了水分子跨膜的全新膜蛋白分子結構基礎。共計于哺乳動物體內發現13種膜嵌入蛋白 (majorintrinsicpro-tein，Mm)家族。研究發現AQP4的亞型：M1、M23聚集狀態決定了其亞細胞分布和功能，其分布有相對的組織特異性，在成熟大腦中AQP4的分布最為廣泛。

AQP4在室管膜、蛛網膜、微血管周圍膠質以及滲透壓感受區高表達。應起調節神經組織水鹽代謝作用[4，5]。AQP4蛋白在神經細胞的分布體現出明顯的極性趨勢，神經元集中區域如核團或神經層的胞體表現高表達，推測AQP4參與與水分子同向轉運[6]。近來，Jin等[7]的結果提示AQP4可影響細胞外容積調節K+的攝取，且K+的攝取可能是AQP4依賴性的，AQP4可能協同調節水和K+穩態，影響神經元電信號水平。實驗中觀察腦挫裂傷后AQP4的表達動態變化規律，證實顱腦損傷后，AQP4表達隨時間變化逐漸增加，并且與路腦損傷程度呈正相關性。這與Taya等[8]的研究結果相符合。

BBB是神經系統的保護界面，使神經系統處于相對隔絕的環境，血管源性腦水腫的主要原因就是BBB的損傷。本研究發現，腦挫傷后神經細胞AQP4的表達與BBB指數在48h內變化呈正相關。其結果提示BBB破壞是腦損傷后早期腦水腫的主要原因之一，細胞毒性腦水腫則可能是亞急性期腦水腫的主要原因之一[9]。調控腦挫裂傷時AQP4的表達，減少BBB的損傷和通透性，可能對繼發性腦損傷的治療提供新的臨床思路。雖然該研究結果類似于其他實驗。本研究只觀察病人在腦挫裂傷后急性期(48h內)AQP4的變化特性，由于就診時間、交通情況、病人術前準備時間等條件約束，未能就傷后2h內和72h后的各種因子特性相類似的探討。也因樣本個體差異，比如年齡、性別、手術操作和病理

標本部位等限制，無法就不同的時段在同一患者顱腦損傷后AQP4檢測進行比較，筆者認為，AQP4在腦挫裂傷后BBB指數的改變，及其影響腦挫裂傷后腦水腫的機制，由于不同的研究方法、手段和觀測時段，結論可能存在差，需要擴大樣本采集時間，改進研究方法，降低個體差異(如性別、年齡、身體狀況等)，進一步詳細的觀察不同時間點，應可得到更加可靠和客觀依據，進一步深入研究，預期提高顱腦損傷病人的預后。

參考文獻：

[1] Magni F，Sarto C，Ticozzi D，et al. Proteomic knowledge of human aquaporins [J]．Proteomics，2006，6(20)：5637-5686

[2]王擁軍．神經病學實驗室診斷技術[M]．北京：科技文獻出版社，1998：395-398

[3]Agre P，King LS, Yasui M，et al. Aquaporin water channels-from atomic structure to clinical medicine[J]．Physiol，2002，542(1)：3-16

[4]Jin BJ，Zhang H，Binder DK，et al. Aquaporin-4-dependent K+and water transport modeled in brain extracellular space following neuroexcitation[J].Gen Physiol，2013，141 (1)：119-132

[5]廉嘵宇,張秀峰,宣兆博,等.水通道蛋白4mRNA在大鼠蛛網膜下腔出血后腦水腫中的表達及尼莫地平對其表達的影響[J].黑龍江醫藥科學,2009,32(6):7-8

[6]張帆,許國英.水通道蛋白-4與缺血性腦水腫[J].黑龍江醫藥科學,2005,28(6):80-81

[7]Yang B，Zador Z，Verkman AS．Glial cell aquaporin-4 overexpression in transgenic mice accelerates cytotoxic brain swelling[J]．J Biol Chem，2008，283(22)：15280-15286

[8]Taya K，Marmarou CR，Okuno K，et al．Effect of secondary insults upon aquaporin -4 water channels following experimental cortical contusion in rats[J]． J Neurotrauma，2010，27 (1):229-239

[9]劉永剛,姜鳳,姜堯佳.高血壓性腦出血周圍腦組織超微結構及腦水腫發生機制研究[J].黑龍江醫藥科學,2015,38(2):142-145

中圖分類號：R642

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2015)06-0027-02

基金項目：①黑龍江省衛計委科研課題，編號：2013-259。

作者簡介：姜廣宇(1981～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫師。

通訊作者：董航(1979～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫師。E-mail:donghang1006@sina.com。

(收稿日期：2015-09-20)