黃芪當歸合劑對梗阻性腎病大鼠E-cadherin和α-SMA表達的影響①

李　麗 ,王長山，李懷荊，楊占雙，聶　影，楊　松，聶　晶

(1.佳木斯大學附屬第一醫院, 黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學基礎醫學院, 黑龍江 佳木斯 154007)

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黃芪當歸合劑對梗阻性腎病大鼠E-cadherin和α-SMA表達的影響①

李麗1,王長山2，李懷荊2，楊占雙1，聶影1，楊松1，聶晶1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院, 黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學基礎醫學院, 黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：探討黃芪當歸合劑(A&A)在梗阻性腎病中抗纖維化的可能作用機制。方法: 將30只成年雄性大鼠隨機分為: 假手術組( sham 組) 10只,模型組10只(單側輸尿管結扎, UUO組)，治療組(A&A組)10只。于術后14d處死,留取腎組織。光鏡觀察腎臟病理形態學改變,采用免疫組化檢測腎組織E-cadherin和α-SMA蛋白表達。結果:① HE和Masson染色觀察到UUO組出現明顯的纖維化表現;②免疫組化結果顯示：與假手術組比較，模型組和治療組E-cadherin的下調伴有α-SMA表達上調(P<0.05)；與模型組比較，治療組14d E-cadhelin蛋白下降(P<0.05)，E-cadhelin蛋白表達量升高(P<0.05)。結論: 黃芪當歸合劑的抗纖維化作用機制，可能通過抑制EMT進程發揮作用。

關鍵詞:腎小管間質纖維化; UUO; E-cadherin;α-SMA

梗阻性腎病(obstructive nephropathy)是由泌尿道結構和(或)功能改變，阻礙尿液的排出，導致腎實質病理和功能損害的臨床綜合征。據統計, 兒童梗阻性腎病占所有終末期腎臟疾病(end-stage renal disease， ESRD)的0.3%，占所有兒童腎移植的16.1%。病理學特征主要表現為腎小管萎縮和間質纖維化，腎小管上皮細胞-間充質細胞轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腎間質纖維化的重要發病機制之一[1，2]。單側輸尿管結扎(unilateral ureteral obstruction，UUO)制作的梗阻性腎病模型是誘導腎纖維化最經典的模型[1，2]。

在腎間質纖維化的防治方面, 祖國傳統醫學積累了許多寶貴經驗[3]，經臨床和實驗研究證實, 具有益氣活血作用的黃芪和當歸組方而成的黃芪當歸合劑(Astragalus and Angelica, A&A ) 可明顯改善腎臟病的蛋白質和脂質代謝紊亂、提高血漿白蛋白；減輕炎癥細胞浸潤、下調轉化生長因子(TGF-β1)的高表達等不同途徑和環節減輕腎間質纖維化[4,5]。但關于A&A在腎間質纖維化腎小管上皮細胞-間充質細胞轉化中的研究相對較少，本實驗需通過建立UUO大鼠模型，探討A&A的治療后，EMT細胞表型特異性標志物E-cadherin和α-SMA的變化情況，了解 A&A在腎間質纖維化中的作用機制，為臨床進行腎間質纖維化防治提供實驗性理論依據。

1　材料和方法

1.1模型制備及分組

雄性清潔級Wistar大鼠30只(由佳木斯大學實驗動物中心提供)。以隨機排列表法隨機分為：假手術組(sham組)、模型組(UUO組)和治療組(A&A組)，每組10只，以10%的水合氯醛(300㎎/㎏)腹腔注射麻醉后，行左側恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左輸尿管，用4-0號絲線上下結扎兩處，從中剪斷輸，分層縫合關閉腹腔。假手術組,分離輸尿管不結扎，隨即縫合腹腔。動物清醒1h后，A&A組灌胃給藥(3mL/d，黃芪、當歸生藥各0.7g/mL)；sham組和 UUO組給予等量清水[1]。

1.2取材

每組大鼠于術后14d處死，取左側腎臟，一部分置4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，待做病理形態學檢測和免疫組化染色。

1.3病理形態學觀察

通過HE染色，光鏡下觀察腎間質纖維化、蛋白管型、腎小管擴張和腎間質炎細胞浸潤程度判定腎小管間質損傷的程度。每個參數分為4個等級： 0分為正常，1分為輕度受損，2分為中度受損，3分為重度受損，每個樣本小管間質損傷評分總分為0~9分。通過Masson染色，借助圖像分析軟件定量分析腎間質纖維化程度。每例切片取10個不重復的400倍視野,以藍色膠原沉積為陽性,計算藍染面積占整個視野的百分比，得出腎間質膠原面積與視野內腎小管間質總面積(去除腎小管管腔)的比值,取其平均值為每例切片的腎間質相對面積[1]。

1.4免疫組化檢測E-cadherin和α-SMA蛋白表達

取腎組織，制備5μm厚連續切片，按試劑盒操作，一抗E-cadherin和α-SMA。二抗為羊抗兔SP檢測試劑盒，DAB顯色，陽性結果為棕黃色。每張切片隨機取10個400×高倍視野，陽性結果呈棕黃色或棕褐色顆粒，通過圖像采集軟件和圖像分析軟件，測出陽性部分平均光密度值，進行分析比較。

1.5統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件，數據采用均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05有統計學意義。

2　結果

2.1HE染色

UUO組術后14 d腎小管結構嚴重破壞，腎小管萎縮，腎小管、集合管擴張呈囊狀，管腔塌陷，上皮細胞大量壞死，腎間質彌漫性巨噬細胞、淋巴細胞浸潤和成纖維細胞增生及膠原形成。sham組大鼠腎臟腎小管結構正常、排列緊密整齊，間質未見增寬，無炎性細胞浸潤，小管基底膜光滑完整。兩組腎小管損傷程度評分比較有統計學差異(P<0.05)[1]。 見表1。

2.2Masson染色

UUO術后14d可見膠原沉積，腎間質逐漸增寬，間質細胞及細胞外基質成分增多；sham組腎臟膠原染色主要位于小管基膜、腎小囊、系膜區和腎小管間的毛細血管周圍，而小管周圍間質染色較少。UUO組腎間質纖維組織相對面積較sham組明顯增高(P<0.05)[1]，見表1。

表1大鼠腎小管損傷程度評分和腎間質相對面積比較

腎小管損傷程度腎間質相對面積sham組0.15±0.101.89±0.30UUO組6.12±0.89a32.70±2.51a

aP<0.05與sham組比較。

2.3免疫組化檢測E-cadherin 蛋白表達

E-cadherin是上皮細胞表面標志，陽性染色鏡下呈棕黃色。sham組腎小管上皮細胞中可見大量E-cadherin表達；UUO組術后14d在腎小管上皮中E-cadherin表達大量消失，僅見片狀、弱表達；A&A組在14d在腎小管上皮中E-cadherin表達部分消失，UUO組與sham組平均密度值比較有統計學差異(P<0.05)；UUO組和A&A組平均密度值的比較(P<0.05)，差異有統計學意義[1],見表2 。

2.4免疫組化檢測α-SMA蛋白表達

α-SMA蛋白為細胞漿染色，陽性染色鏡下呈棕黃色。在sham組大鼠腎小球、腎小管以及腎間質均未見表達，僅表達于腎動脈血管平滑肌細胞。UUO組術后14d在腎間質和腎小管上皮細胞見較多α-SMA表達； A&A組14d可見α-SMA，較UUO組表達量減少。UUO組與sham組平均密度值比較有統計學差異(P<0.05)；A&A組與UUO組平均光密度值的比較,差異有統計學意義(P<0.05)[1],見表2。

表2　免疫組化檢測各組大鼠腎皮質E-cadherin和α-SMA蛋白的表達量

aP<0.05，與sham組比較；bP<0.05，UUO組內比較。

3　討論

腎間質纖維化的過程包括腎小管的損傷、細胞外基質(ECM)的過多沉積、多個細胞因子參與的復雜過程[6]。腎間質纖維化(Renal Interstitial Fibrosis， RIF)是梗阻性腎病與其他各種慢性腎病發展至終末期腎功能衰竭的共同通路和重要原因。作為慢性腎功能衰竭的進行性發展過程中的始動因素，RIF被認為比腎小球病變更能反映慢性腎功能衰竭的進展速率及預后。RIF的發病機制是一復雜的慢性病理過程，臨床上缺乏有效、可靠的治療方法，RIF導致的ESRD需依賴透析治療或腎臟移植，為此需要耗費巨大的財力、人力和物力，對患者、家庭和社會造成巨大負擔。因而阻滯或延緩RIF進程是抑制或逆轉進行性腎功能惡化的關鍵[1]。

UUO 是誘導腎纖維化最經典的模型，劉中柱等亦通過結扎大鼠單側輸尿管建立UUO模型，免疫組化等觀察大鼠腎臟的病理變化[6~9],也有應用馬兜鈴酸引起腎病腎間質纖維化模型的[10]。在本研究中，通過HE和Masson染色觀察UUO模型的尿路梗阻后腎臟纖維化表現，腎間質淋巴細胞浸潤；腎小管擴張、腎間質膠原纖維沉積等。證明UUO模型造模成功[1]。

中藥在慢性腎病的治療中具有一定的作用。研究表明，由黃芪和當歸組方的黃芪當歸合劑通過抑制ECM 的生成而減輕腎臟纖維化。新近研究發現A&A 能夠抑制間質纖維化腎臟中纖溶酶原激活物抑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1) mRNA 的表達，提示A&A可能通過調控ECM降解，減輕腎臟纖維化[1]，A&A 還能夠下調結締組織生長因子(CTGF)和纖黏連蛋白(FN)的表達, 抑制腎纖維化[11,12]。但是，對于A& A 的抗纖維化作用及其機制目前尚未完全明確。

E-cadherin是腎小管上皮細胞特征性標志，在EMT時首先消失；α-SMA是肌成纖維細胞標志性蛋白己得到公認[13]。本實驗研究證實，在腎間質纖維化的UUO動物模型中存在著E-cadherin表達的下調，這與yang等[14]學者的研究結果相似。與此同時，α-SMA蛋白表達呈現明顯的上調趨勢，研究結果提示，UUO大鼠在腎間質纖維化的同時伴有E-cadherin的下調和標志物α-SMA表達增加，提示腎小管上皮細胞發生了EMT。本實驗研究顯示，經黃芪當歸合劑治療14d E-cadhelin蛋白表達量較UUO組下降，E-cadhelin蛋白表達量明顯高于UUO組，這一結果說明黃芪當歸合劑可抑制腎小管腎小管上皮細胞轉分化的過程，延緩腎間質纖維化的進程。提示A&A 的抗纖維化作用機制，可能通過抑制EMT進程發揮作用，其具體分子機制及信號通路還有待進一步研究。

參考文獻：

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中圖分類號：R285.6;R691.2

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2015)06-0004-02

基金項目：①1.黑龍江省青年科學基金項目，編號：QC2012C119；2.黑龍江省衛生廳項目，編號：2012-198；3.佳木斯大學科學技術重點項目，編號：Sz 2014-011。

作者簡介:李麗( 1979～ )女,黑龍江佳木斯人,博士,副教授，碩士研究生導師。

通訊作者:王長山( 1977～ )男,黑龍江佳木斯人,博士，副教授,碩士研究生導師。E- mail: wcs0451@163.com。

(收稿日期：2015-07-08)