刺五加提取物對睡眠剝奪小鼠抗氧化抗疲勞的研究①

張淑萍，王亞軍，胡春榮，吳成吉，宣兆博，劉文娟，楊利敏，黃作義

(佳木斯大學附屬第一醫院神經科，黑龍江 佳木斯 154003)

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刺五加提取物對睡眠剝奪小鼠抗氧化抗疲勞的研究①

張淑萍，王亞軍，胡春榮，吳成吉，宣兆博，劉文娟，楊利敏，黃作義

(佳木斯大學附屬第一醫院神經科，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的:探討刺五加提取物對睡眠剝奪小鼠抗氧化的作用及對抗疲勞的影響。方法:將小鼠隨機分為正常對照組、VE對照組、睡眠剝奪組、刺五加提取物低劑量組(1mg/g·d)、中劑量組(2mg/g·d)、高劑量組(4mg/g·d)。采用小平臺水環境法制作大鼠睡眠剝奪模型。觀察小鼠一般狀態，舌下靜脈取血后測定血清SOD和MDA的含量。將刺五加提取物灌胃給藥的小鼠進行力竭游泳實驗后檢測血乳酸水平。結果:與睡眠剝奪組相比，刺五加提取物能夠顯著提高小鼠血清SOD的含量，降低血清MDA的含量，并且降低小鼠運動后乳酸水平，延長小鼠力竭游泳時間。結論:刺五加提取物可以提升小鼠體內抗氧化和抗疲勞的能力。

關鍵詞：睡眠剝奪；刺五加提取物；抗氧化；抗疲勞

睡眠剝奪(sleep deprivation,SD)是指在各種病理或生理狀態下，因機體睡眠喪失而引起的一系列臨床癥狀的疾病。隨著生活壓力的逐漸加大，它已成為當代社會的一種普遍現象，長期的睡眠剝奪會對中樞神經系統產生重大的影響，且加速機體的氧化衰老，加重疲勞[1,2]。隨著國內外對睡眠剝奪研究的逐漸深入，睡眠剝奪這一現象也逐漸備受重視，但目前關于刺五加對睡眠剝奪小鼠的研究報道甚少。通過此次研究，我們試圖探究刺五加提取物對被睡眠剝奪小鼠的治療效果，為今后睡眠剝奪的治療提供新途徑，為臨床研究做出貢獻。

1　材料與方法

1.1刺五加提取物體內抗氧化實驗

1.1.1實驗材料:UV757CRT 紫外可見分光光度計(上海玉田分析儀器公司)；HH-S26S型電熱恒溫水浴鍋 (北京中西遠大科技有限公司)；電子天平(常州萬泰天平儀器有限公司)；高速臺式離心機(湖南凱達儀器有限公司)；D-半乳糖(D-Galactose)； 超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(北京杰輝博高生物技術有限公司))；丙二醛(MDA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)；昆明種小鼠 (南京君科生物工程有限公司)；刺五加提取物(西安品誠生物科技有限公司)。

1.1.2實驗分組與動物模型建立:將60只小鼠隨機分為6組，分別為正常對照組、睡眠剝奪組、刺五加提取物高劑量組、中劑量組、低劑量組、維生素E對照組。根據參考文獻[3]用D-半乳糖構建小鼠衰老模型。根據參考文獻[4]，采用小平臺水環境法，自制鼠箱制造大鼠睡眠剝奪模型[5]。

1.1.3給藥方法：刺五加提取物低、中、高劑量組給藥量分別為1mg/g·d、2mg/g·d、4mg/g·d，維生素E對照組給予0.05mg/g·d的維生素E灌胃,空白對照組、睡眠剝奪組用0.02mL/g·d的生理鹽水灌胃，連續給藥30d。

1.1.4標本的采集及檢測：觀察小鼠的一般情況(精神，活動狀態，大小便等)，并認真記錄各項實驗結果。記錄完畢后，所有動物均于同一時間內對小鼠進行舌下靜脈采血[4]，3500r/min離心10min，取血清，做好標記，-20℃保存待測。用紫外分光光度法檢測小鼠血清中MDA和SOD的含量(按照試劑盒說明)。

1.1.5免疫器官指數的測定：將小鼠稱重，脫頸椎處死后測定免疫器官指數[6]。

1.2刺五加提取物抗疲勞實驗

1.2.1實驗材料：UV757CRT紫外可見分光光度計(上海玉田分析儀器公司)；HH-S26S型電熱恒溫水浴鍋 (北京中西遠大科技有限公司)；電子天平(上海麥尚科學儀器有限公司)；血乳酸試劑盒(上海弘順生物科技研究所)；昆明種小鼠(南京君科生物工程有限公司)；刺五加提取物(西安品誠生物科技有限公司)。

1.2.2實驗分組與動物模型建立：將40只小鼠隨機分為4組，每組10只：刺五加提取物低劑量組(1mg/g·d)、中劑量組(2mg/g·d)、高劑量組(4mg/g·d)和對照組，對照組灌胃0.02mL/g·d的生理鹽水，連續給藥30d。根據參考文獻[5]的方法，采用小平臺水環境法，自制鼠箱復制SD動物模型。利用此裝置可以制造大鼠睡眠剝奪模型。

1.2.3體重測定與力竭游泳時間的測定：用電子天平測定實驗開始及結束時小鼠體重的變化。進行小鼠力竭游泳實驗[7]，記錄數據。

1.2.4血乳酸測定:根據文獻[7]，對血乳酸進行定量測定。

1.3統計學方法

2　結果

2.1刺五加提取物體內抗氧化實驗

2.1.1一般情況的觀察： 正常對照組小鼠行為敏捷，皮毛光滑，大便黃褐色，無腥臭，成形；睡眠剝奪組小鼠開始出現精神不振、扎堆、瞇眼、消瘦、反應緩慢等現象，毛色黯淡無光、小鼠大便稀溏、有腥臭；與正常組相比，刺五加提取物4mg/g·d、2mg/g·d劑量組小鼠活動頻率如常，攝食尚可，為深褐色軟便，基本無變化。而刺五加提取物1mg/g·d劑量組及維生素E(VE)對照組小鼠毛色較暗，反應略遲緩，少數小鼠大便稀。除正常對照組和刺五加提取物2mg/g·d劑量組外，其余四組均有小鼠死亡，其中睡眠剝奪組死亡2只，4mg/g·d、1mg/g·d劑量組及VE對照組各死亡1只。

2.1.2免疫器官指數：與正常組比較，睡眠剝奪組、1mg/g·d劑量組脾臟指數和胸腺指數均顯著降低(*P<0.05)，而2mg/g·d、4mg/g·d劑量組與正常組比較脾臟指數、胸腺指數無顯著差異(*P>0.05)。四個治療組與睡眠剝奪組比較脾臟指數、胸腺指數顯著升高(▲P<0.05)。因此，刺五加提取物三個治療組均可升高小鼠免疫器官指數，且升高幅度隨劑量的增減而增減。VE對照組也可有效升高小鼠免疫器官指數，而刺五加提取物高劑量組要高于VE對照組。

表1　免疫器官指數的測定

組別動物數脾臟指數(mg/g)胸腺指數(mg/g)正常對照組104.86±0.251.16±0.18睡眠剝奪組83.09±0.31*0.82±0.11*VE對照組94.12±0.29*▲0.91±0.18*▲低劑量組93.99±0.36*▲0.87±0.15*中劑量組94.35±0.27*▲1.02±0.19*▲高劑量組104.66±0.33*▲1.14±0.13*▲

2.1.3血清超氧化物歧化酶(SOD)活性:與正常組比較，睡眠剝奪組、VE對照組、1mg/g·d劑量組血清SOD活性顯著降低(*P<0.05)，而2mg/g·d、4mg/g·d劑量組與正常組比較無顯著差異(*P>0.05)。1mg/g·d、2mg/g·d、4mg/g·d劑量組與睡眠剝奪組比較有明顯升高(▲▲P<0.01)；VE對照組與睡眠剝奪組比較有明顯升高(▲P<0.05)。刺五加提取物能增強血清SOD的活性，且升高幅度隨劑量的增減而增減。VE對照組也能有效增強血清SOD的活性，但刺五加提取物2mg/g·d、4mg/g·d劑量組要優于VE對照組。

表2　血清超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測±s)

2.1.4血清丙二醛(MDA)含量：睡眠剝奪組、VE對照組、1mg/g·d劑量組丙二醛(MDA)的含量較正常組比顯著升高(*P<0.01)，2mg/g·d劑量組含量升高*(P<0.05)，而4mg/g·d劑量組與正常組比較血清MDA的含量無顯著差異(P>0.05)。1mg/g·d、2mg/g·d、4mg/g·d劑量組與睡眠剝奪組比較血清MDA的含量均顯著降低(▲P<0.01)；VE對照組與1mg/g·d劑量組MDA的含量無顯著差異(P>0.05)；4mg/g·d、2mg/g·d劑量組MDA的含量顯著低于VE對照組(P<0.01)；4mg/g·d劑量組MDA含量顯著低于低劑量組(▲▲P<0.01)。可見刺五加提取物能顯著降低血清MDA含量，且降低幅度隨劑量的增減而增減。VE對照組也能有效降低血清MDA含量，但刺五加提取物4mg/g·d、2mg/g·d劑量組要優于VE對照組。

表3　血清丙二醛(MDA)含量檢測

組別動物數MDA(nmol/mL)正常對照組106.92±0.79睡眠剝奪組813.71±0.96*VE對照組99.88±0.64*低劑量組99.25±0.74*▲中劑量組108.53±0.59*▲高劑量組97.48±0.81▲▲

2.2刺五加提取物抗疲勞實驗

2.2.1體重測定：各組小鼠實驗開始及結束時的體重與對照組比較差異不明顯(*P>0.05)，這說明刺五加提取物不能顯著增長小鼠的體重。

表4　刺五加提取物對小鼠體重的影響±s,n=8)

2.2.2力竭游泳時間測定：2mg/g·d、4mg/g·d劑量組小鼠力竭游泳時間均顯著高于對照組小鼠(*P<0.05)。1mg/g·d劑量組小鼠的力竭游泳時間的個體間的差異比較大，統計結果無明顯差異。即刺五加提取物對延長小鼠力竭游泳的時間起到顯著改善作用，其中以2mg/g·d劑量組作用最明顯。

表5　力竭游泳時間測定

組別力竭游泳時間(s)對照組912±367低劑量組1481±513中劑量組2921±603*高劑量組3296±474*

2.2.3血乳酸測定:小鼠游泳30min后，分別眼眶采血檢測血乳酸。2mg/g·d劑量組小鼠血乳酸水平顯著低于對照組(**P<0.01)，1mg/g·d劑量組、4mg/g·d劑量組小鼠的血乳酸水平低于對照組(*P<0.05)。說明刺五加提取物能夠降低運動后小鼠血乳酸的水平，其中以2mg/g·d劑量組效果最明顯。

表6　血乳酸測定

組別運動前血乳酸運動后血乳酸對照組4.75±0.6313.28±1.28低劑量組4.52±0.598.95±1.42*中劑量組4.71±0.498.32±1.65**高劑量組4.45±0.718.67±1.79*

3　討論

刺五加(Acanthopanax senticocus)為五加科多年生木本植物，其提取物主要有效成分為異秦皮定、綠原酸、芝麻素，硬脂酸，β-谷甾醇、多糖等。刺五加具有抗疲勞、抗癌、抗衰老、抗輻射、抗菌消炎的作用；此外，它還可以改善心血管功能，改善大腦血供，調節內分泌，調節血壓，止咳祛痰，增強免疫力，改善大腦皮質的興奮、抑制過程，提高腦力勞動效能[8]。抗氧化能力是機體生存必不可少的重要條件，一般睡眠剝奪可能導致肌肉酸痛，肌肉萎縮，混亂，記憶的失誤或損失，幻覺，抑郁，眶周浮腫，血壓升高，激素水平升高，肌纖維痛，眼球震顫[9~11](不自主節律性眼球運動)，肥胖，困倦，精神疾病類癥狀，乃至注意缺陷多動障礙(ADHD)也有所報道。

經本實驗研究發現：與對照組相比，睡眠剝奪組小鼠反應遲鈍、精神萎靡、體重下降、毛色黯淡無光，這是由于睡眠剝奪能夠加速機體的新陳代謝使機體營養失調，對外來入侵的病原體抵抗下降，使小鼠體內的抗氧化能力降低，引起小鼠血清中的SOD和MDA的含量發生變化。經過高、中和低三種劑量的刺五加提取物治療后，小鼠血清中的SOD升高，MDA含量降低(均P<0.05)，而且其療效均與劑量呈正相關，并且小鼠的一般情況明顯改善，其表現較對照組基本相同如反應靈敏、毛色光澤，攝食量正常等。在給小鼠灌入刺五加提取物后進行力竭游泳實驗，結果示2mg/g·d、4mg/g·d劑量組小鼠力竭游泳時間顯著高于對照組小鼠(P<0.05)。1mg/g·d、2mg/g·d、4mg/g·d劑量組小鼠的血乳酸水平顯著低于對照組(P<0.05)，表明刺五加提取物能夠顯著降低運動后小鼠血清乳酸的濃度。以上研究均表明刺五加提取物能夠顯著提升睡眠剝奪小鼠體內抗氧化及抗疲勞的能力。

刺五加的活性成分大都具有酚羥基，可抗氧化，抗疲勞，使注意力集中，減少工作失誤。本實驗表明，大鼠在睡眠剝奪后，隨著時間的延長，機體抗氧化能力降低，刺五加提取物能夠明顯改善上述癥狀并且對抗疲勞。

參考文獻:

[1]賈秀月，高艷華.自由基與抗衰老的研究概況[J].黑龍江醫藥科學,2007,29(2)：37-39

[2]Locke SE, Kraus L, Leserman J, et al. Life chang stress, psychiatric symptoms and natural kill cell activity[J].Psychosom Med,1984,46(8):441-446

[3]徐輝,魏曉東,歐芹,等.1D-半乳糖衰老模型大鼠肝臟形態學及抗氧化能力變化的研究[J].黑龍江醫藥科學,2005,28(10):26-27

[4]姜波濤.探討一種新的大鼠取血方法舌下靜脈采血[J].臨床和實驗醫學雜志,2011,10(5):384

[5]Machado RB , Hipolide DC , Benedito Silva AA , et al. Sleep deprivation induced by the modified multiple plat form t ech nique:quantification of sleep loss and recovery[J] .Brain Res,2004,1004(1-2): 45-51

[6]李儀奎主編.中國藥理實驗方法學[M].上海:上海科學出版社,1991,155-167

[7]江海濤,任源浩,吳雨龍,等.蛹蟲草多糖對小鼠抗疲勞作用的研究[J].食用菌學報,2014,21(3):55-59

[8]趙蕾,魏曉東,葛堂棟,等.黃芪血清對衰老細胞抗氧化作用及p16表達影響的研究[J].黑龍江醫藥科學,2006,29(10):4-5

[9]孟玲欣,范貴民,王景濤.改良多平臺水環境法制作大鼠REM睡眠剝奪模型的研究[J].黑龍江醫藥科學,2013,36(2):99

[10]劉娟,郝春艷,李鳳偉.柳蘭鞣質含量動態分析及體外抗氧化作用研究[J].黑龍江醫藥科學,2014,37(3):19-21

[11]Citek K,Ball B,Rutledge,et al.Nystagmus testing in intoxicated individuals[J].Optometry St Louis Mo,2003,74(11):695-698

中圖分類號：R285.6

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0104(2015)06-0001-03

基金項目：①黑龍江省自然科學基金項目，編號：C2012-42。

作者簡介：張淑萍(1969~)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。

通訊作者：黃作義(1963~)男，黑龍江雞西人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail: blcldxn@163.com。

(收稿日期：2015-06-05)