坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷大鼠脊髓背角γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的比例變化觀察

陳朝輝，劉虹，劉洋

(1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,四川南充 637000;2遂寧市中心醫(yī)院)

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坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷大鼠脊髓背角γ-氨基丁酸能神經(jīng)元的比例變化觀察

陳朝輝1，劉虹2，劉洋1

(1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,四川南充 637000;2遂寧市中心醫(yī)院)

摘要：目的觀察坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(SNI)模型大鼠脊髓背角γ-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元比例的變化。方法健康雄性SD大鼠36只，隨機分為SNI組(S組)和假手術(shù)組(D組)，各18只。S組暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)主干及三個分支，結(jié)扎切斷脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，保留腓腸神經(jīng)。D組僅暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)主干及其分支，不行結(jié)扎。術(shù)前1天和術(shù)后7、14、28天分別進行大鼠左后爪內(nèi)外側(cè)機械痛閾測試。造模后7、14、28天兩組大鼠分批取材(n=6)行4%多聚甲醛心臟灌注，取腰脊髓段(L5)制備石蠟切片，免疫組化染色定位GABA能神經(jīng)元，并運用體視學(xué)形態(tài)定量分析兩組大鼠脊髓背角GABA能神經(jīng)元比例。結(jié)果S組大鼠術(shù)后7、14、28天左側(cè)脊髓背角GABA能陽性神經(jīng)元比例分別為60.41%±8.49%、55.27%±6.80%、61.87%±8.12%，右側(cè)脊髓背角GABA能陽性神經(jīng)元比例分別為61.94%±11.04%、64.68%±9.77%、62.58%±4.25%，D組大鼠術(shù)后7、14、28天左側(cè)脊髓背角GABA能陽性神經(jīng)元比例分別為61.27%±8.73%、63.59%±5.97%、62.81%±10.26%，右側(cè)脊髓背角GABA能陽性神經(jīng)元比例分別為58.02%±4.58%、60.84%±8.28%、63.74%±10.88%，S組術(shù)后14天左側(cè)GABA能神經(jīng)元比例較同組右側(cè)、D組左側(cè)低，P均<0.05。結(jié)論 SNI模型大鼠神經(jīng)損傷側(cè)脊髓背角GABA能神經(jīng)元比例降低，但這種改變并不持久，GABA能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化可能與SNI大鼠機械性痛敏有關(guān)。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)病理性疼痛；機械性痛閾；GABA能神經(jīng)元；脊髓背角；體視學(xué)

神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的一種難以治療的慢性痛狀態(tài)，其發(fā)病機制不明，治療效果欠佳。坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷(SNI)模型是神經(jīng)病理性疼痛的常用模型，具有神經(jīng)損傷程度固定、可重復(fù)性好、產(chǎn)生的行為學(xué)持久、能夠提供接近模擬臨床神經(jīng)病理性疼痛的許多特征等特點[1]。有研究[2]表明，脊髓背角Ⅰ～Ⅲ板層γ-氨基丁酸(GABG)能神經(jīng)元等抑制性中間神經(jīng)元與神經(jīng)病理性疼痛密切相關(guān)，但詳細機制尚不明確。脊髓背角GABA能神經(jīng)元在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生過程中的變化和作用仍存在爭議[3～5]。因此，本實驗采用體視學(xué)的方法分析SNI大鼠脊髓背角GABA能神經(jīng)元比例的變化，探討神經(jīng)病理性疼痛的機制。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組36只清潔級成年健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量260～310 g，由川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供,隨機分為假手術(shù)組(D組)和SNI組(S組)，各18只。

1.2主要試劑和儀器 GABA多克隆抗體購自英國Abcam公司，免疫組化筆購自日本CIRISC公司，SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物有限公司；德國Leica切片機；意大利動態(tài)足底觸覺儀(Ugo Basile公司)；日本培養(yǎng)倒立顯微鏡(TS100-F，Nikon公司)；丹麥Visopharm體視學(xué)圖像系統(tǒng)。

1.3SNI模型制備腹腔注射3%戊巴比妥鈉按(50 mg/kg)麻醉兩組大鼠，S組大鼠麻醉后，俯臥固定于鼠板上，手術(shù)部位剪毛暴露皮膚，常規(guī)碘伏消毒鋪巾，充分暴露并分離左側(cè)坐骨神經(jīng)三個分支(脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)、腓腸神經(jīng))，用3-0醫(yī)用真絲編織線結(jié)扎脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)，并在結(jié)扎遠端切斷，保留完整腓腸神經(jīng)，然后分層縫合肌肉和皮膚，縫合前在傷口處以30萬單位/kg涂抹青霉素粉劑，并在右后腿肌注5萬單位青霉素預(yù)防術(shù)后感染。D組大鼠麻醉后僅分離暴露三個分支后不做任何處理，分層縫合肌肉和皮膚，涂抹、肌注青霉素預(yù)防感染。

1.4大鼠一般行為學(xué)觀察兩組大鼠在實驗造模前和取材前均測量體質(zhì)量，作為評價其健康狀況和生長情況的指標，同時記錄各組大鼠術(shù)后一般情況。實驗過程中，將大鼠放在動態(tài)足底觸覺儀的長方形透明盒內(nèi)，觀察各組大鼠的活動狀態(tài)、行走步態(tài)和后爪形態(tài)有無改變,并對大鼠的行為學(xué)情況[1級：活動狀態(tài)正常，后爪無畸形；2級：活動狀態(tài)正常，有明顯后爪畸形(攣縮)；3級：輕度活動異常，有垂足現(xiàn)象；4級：嚴重活動異常，術(shù)側(cè)后腿癱瘓]進行評估。

1.5大鼠機械性痛閾測試兩組大鼠均在術(shù)前1天和術(shù)后7、14、28天采用動態(tài)足底觸覺儀測量左后爪內(nèi)側(cè)面(隱神經(jīng)區(qū)域)和外側(cè)面(腓腸神經(jīng)區(qū)域)的機械痛閾，以術(shù)前1天的測定值作為基礎(chǔ)值，測定時間均為下午2點到4點。

1.6大鼠脊髓背角GABA能陽性神經(jīng)元定位手術(shù)操作后7、14、28天，S組和D組分批取材(n=6)，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,200 mL生理鹽水行心臟灌注，繼以4%多聚甲醛固定液先快后慢灌注固定約300 mL,固定后取腰段L5脊髓組織,逐級乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片。常規(guī)脫蠟至水后，3% H2O2孵育10 min，經(jīng)熱抗原修復(fù)，5% BSA封閉液封閉20 min，滴加GABA多克隆抗體(1∶500)孵育(4 ℃)過夜。接著依次用生物素標記的羊抗鼠兔IgG孵育(37 ℃)20 min，0.01 mol/L的PBS漂洗3次，每次3 min后，滴加試劑辣根酶標記鏈酶卵白素(SABC)1～2滴，37 ℃孵育20 min，0.01 mol/L的PBS漂洗4次，每次5 min，最后在室溫下用DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染2 min，0.5%鹽酸乙醇分色,常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。

1.7大鼠脊髓背角GABA能陽性神經(jīng)元比例觀察取兩組大鼠上述各時間點免疫組化染色效果較好的切片，采用Visopharm體視學(xué)圖像系統(tǒng)及Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)觀察。每張切片中用Layer Drawing分別勾畫出左側(cè)與右側(cè)脊髓背角，10倍物鏡下疊加10×10個點，點面積24 020.99 μm2，統(tǒng)計所勾畫范圍內(nèi)的點的個數(shù)(N)，然后在100倍物鏡下疊加2個光學(xué)體視框，每個框左上角作為測點，框面積為55.00 μm×41.41 μm=2 211.6 μm2，設(shè)置抽樣分數(shù)為7%，從切片表面下1 μm深度開始調(diào)節(jié)焦距，計數(shù)5 μm深度有效體視框內(nèi)聚焦清晰的細胞數(shù)量。GABA能陽性與陰性神經(jīng)元判斷標準：陽性神經(jīng)元細胞核大而圓，核仁明顯，胞質(zhì)內(nèi)GABA遞質(zhì)著色呈棕黃色或黃褐色；陰性神經(jīng)元細胞核大而圓，核仁明顯，胞質(zhì)不著色。每張切片分別按照以上方法統(tǒng)計GABA能陽性神經(jīng)元的個數(shù)與陰性神經(jīng)元的個數(shù)，估算脊髓背角手術(shù)側(cè)與非手術(shù)側(cè)的GABA能神經(jīng)元數(shù)目占總神經(jīng)元數(shù)目的比例。

2結(jié)果

2.1兩組一般行為學(xué)比較術(shù)前兩組大鼠體質(zhì)量比較無明顯差異，術(shù)后至取材前各時點兩組大鼠體質(zhì)量正常增長，兩組同時點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有大鼠術(shù)前體型及步態(tài)均正常，左后爪形態(tài)正常，反應(yīng)及活動能力無異常。S組大鼠術(shù)后手術(shù)側(cè)(左側(cè))后爪出現(xiàn)足外翻畸形、攣縮和自發(fā)性縮足反應(yīng)，其中有4只大鼠評級達到3級，其余大鼠評級均為2級。D組大鼠術(shù)后活動、步態(tài)和后爪形態(tài)與術(shù)前比較無明顯異常，評級均為1級。兩組術(shù)后一般行為學(xué)比較，P<0.05。

2.2兩組機械痛閾比較兩組大鼠左后爪內(nèi)外側(cè)面機械痛閾比較見表1。

表1　 兩組大鼠左后爪內(nèi)外側(cè)面機械痛閾比較±s)

注：與同組術(shù)前1天比較，*P<0.05；與對照組同時點比較，#P<0.05。

注：與同組右側(cè)比較，*P<0.05；與對照組同時點比較，#P<0.05。

2.3兩組脊髓背角GABA能陽性神經(jīng)元比例比較免疫組化染色結(jié)果顯示，大鼠脊髓背角GABA能神經(jīng)元大小不等，體積以中小型細胞為主，GABA遞質(zhì)呈均質(zhì)狀分布于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)，包繞細胞核。兩組大鼠左右側(cè)脊髓背角GABA能陽性神經(jīng)元比例結(jié)果見表2。

3討論

本研究中，S組大鼠術(shù)后出現(xiàn)左側(cè)后爪外翻畸形、自發(fā)性縮足反應(yīng)以及機械異常性疼痛等行為學(xué)變化，且這些改變持續(xù)了整個觀察周期，而D組大鼠在整個觀察周期均沒有發(fā)現(xiàn)明顯異常,兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SNI大鼠后爪內(nèi)外側(cè)機械痛閾術(shù)后持續(xù)下降，術(shù)后各時點與術(shù)前基礎(chǔ)值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，D組大鼠后爪內(nèi)外側(cè)機械痛閾術(shù)后各時點與術(shù)前基礎(chǔ)值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果都與Woolf建立的SNI模型[1]一致，說明本實驗大鼠SNI模型建立成功。

本實驗結(jié)果顯示，S組大鼠術(shù)后7、14、28天左側(cè)GABA能神經(jīng)元比例較右側(cè)低，但僅14天時兩側(cè)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。S組大鼠術(shù)后7、14、28天左側(cè)GABA能神經(jīng)元比例較對照組左側(cè)低，但僅第14天時兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。SNI大鼠后脊髓背角術(shù)側(cè)GABA能神經(jīng)元比例在4周內(nèi)出現(xiàn)了一個下降和回升的過程，這可能是GABA能神經(jīng)元發(fā)生了凋亡壞死再生的過程，也可能是GABA能神經(jīng)元發(fā)生了轉(zhuǎn)化。Ibuki等[6]推測CCI大鼠1周后GABA能神經(jīng)元的減少可能是因為GABA遞質(zhì)合成的下調(diào)。研究[7]發(fā)現(xiàn)，CCI大鼠GABA神經(jīng)遞質(zhì)合成酶谷氨酸脫羧酶(GAD)陽性細胞數(shù)從術(shù)后3天在術(shù)側(cè)和非術(shù)側(cè)都開始減少，1周后開始回升，8周時已經(jīng)超過正常值，因此推測CCI大鼠GABA能神經(jīng)元內(nèi)GABA遞質(zhì)減少，以至于胞質(zhì)內(nèi)的GABA濃度低于他們研究方法中的檢測閾值，表現(xiàn)為原來呈GABA能陽性神經(jīng)元轉(zhuǎn)化為了“陰性”，低GABA遞質(zhì)水平作為刺激GABA合成酶GAD表達的正反饋調(diào)節(jié)信號，隨著GAD表達的增加，GABA能神經(jīng)元內(nèi)GABA遞質(zhì)的合成逐漸增多，GABA能陽性神經(jīng)元數(shù)量也呈現(xiàn)增長趨勢，顯現(xiàn)出一種神經(jīng)元“自我修復(fù)”的狀態(tài)。Polgar等[8]研究表明，脊髓中一些甘氨酸神經(jīng)元表現(xiàn)出GABA免疫陽性。本實驗研究中GABA能陽性神經(jīng)元的數(shù)量在短期內(nèi)發(fā)生了下降和回升，神經(jīng)元本身再生的難度較高，我們推測，在GABA能陽性神經(jīng)元減少的過程中，可能發(fā)生了神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化，即原來呈GABA甘氨酸免疫雙陽性的神經(jīng)元在病理性疼痛過程中暫時轉(zhuǎn)化成了甘氨酸免疫單陽性神經(jīng)元。GABA是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在痛覺信息傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，GABA能神經(jīng)元在轉(zhuǎn)化過程中由于GABA遞質(zhì)的數(shù)量發(fā)生變化，功能也可能發(fā)生變化，這可能與SNI大鼠機械痛閾的下降、機械性痛敏的發(fā)生有關(guān)。

以往學(xué)者大都是采用直接鏡下計數(shù)等二維平面內(nèi)統(tǒng)計方法，存在人為偏倚和誤差，而本實驗運用了公認的更為可靠的三維空間體視學(xué)形態(tài)定量方法[9]，通過在所測切片區(qū)域疊加適當?shù)捏w視學(xué)探針，分別計數(shù)GABA能陽性神經(jīng)元與陰性神經(jīng)元個數(shù)，得到每張切片GABA能陽性神經(jīng)元比例，用比例來作為估算GABA能陽性神經(jīng)元數(shù)量改變的指標，排除了石蠟包埋前后組織體積變化的影響[10]，結(jié)果更加準確可靠。

綜上可見，SNI模型大鼠脊髓背角GABA能神經(jīng)元比例降低，且這種改變并不持久,GABA能神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化可能與SNI機械性痛敏的發(fā)生有關(guān)。

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醫(yī)藥學(xué)名詞常見錯誤及正確寫法

藥品名稱：錯誤(正確)

二磷酸腺苷(腺苷二磷酸)，消炎痛(吲哚美辛)，阿斯匹林(阿司匹林)，維甲酸(維A酸)，雙磷酸鹽(雙膦酸鹽)，甲氨喋呤(甲氨蝶呤)，博萊霉素(博來霉素)，開浦蘭(左乙拉西坦)，雷公多苷(雷公藤多苷)，非那根(異丙嗪)，四乙銨(四乙胺)，洗必泰(氯已定)，美息律(美西律)，大環(huán)內(nèi)脂類(大環(huán)內(nèi)酯類)，川穹(川芎)，酒精(乙醇)，頭胞哌酮(頭孢哌酮)。

疾病及其相關(guān)名稱：錯誤(正確)

甲狀腺機能(甲狀腺功能)，血沉(紅細胞沉降率)，X光片(X線片)，帕金森癥(帕金森病)，食道(食管)，適應(yīng)征、適應(yīng)癥(適應(yīng)證)，禁忌征、禁忌癥(禁忌證)，酒精肝(酒精性肝病)，心肌梗塞(心肌梗死)，腦梗塞(腦梗死)，毒副反應(yīng)(不良反應(yīng))，肌肉注射(肌內(nèi)注射)，心率失常(心律失常)，中風(fēng)(卒中)，生理機能(生理功能)，返流(反流)，血液動力學(xué)(血流動力學(xué))，機能(功能)，人流(人工流產(chǎn))，藥動學(xué)(藥代動力學(xué))，綠膿桿菌(銅綠假單胞菌)，機理(機制)，圍產(chǎn)期(圍生期)，氧和指數(shù)(氧合指數(shù))，慢性阻塞性肺病(慢性阻塞性肺疾病)，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)，血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶抑制劑(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑)，咳血(咯血)，心房纖顫(心房顫動)，腦溢血(腦出血)，穩(wěn)定性心絞痛(穩(wěn)定型心絞痛)，法樂四聯(lián)癥(法洛四聯(lián)癥)，非何杰金淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)，視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤(視網(wǎng)膜母細胞瘤)，剖腹產(chǎn)術(shù)(剖宮產(chǎn)術(shù))。

其他：錯誤(正確)

粘附(黏附)，粘痰(黏痰)，粘液(黏液)，粘滯(黏滯)，粘膜(黏膜)，粘多糖(黏多糖)，多粘菌素(多黏菌素)，粘質(zhì)沙雷菌(黏質(zhì)沙雷菌)，層黏聯(lián)蛋白(層黏連蛋白)，機率、幾率(概率)，脫臘(脫蠟)，側(cè)枝循環(huán)(側(cè)支循環(huán))，縱膈(縱隔)，紅血球(紅細胞)，白血球(白細胞)。

Proportion changes of GABAergic neurons in spinal dorsal horn of SNI rats

CHENZhao-hui1, LIU Hong, LIU Yang

(1AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,China)

Abstract:Objective To observe the proportion changes of γ-aminobutyric acid (GABA)ergic neurons in spinal dorsal horn (SDH) of SNI (spared nerve injury) model rats.MethodsThirty-six healthy male SD rats were randomly divided into two groups: SNI group (group S, n=18) and sham operation group (group D, n=18). The left sciatic nerve trunk and three branches were exposed, two of which, known as tibial and peroneal nerve, were ligated and cut off, and the sural nerve was preserved to build the SNI model in the group S. The left sciatic nerve trunk and three branches were only exposed in the group D. On the 1st day before surgery, 7th, 14th and 28th days after surgery, the outside and inside MWTs (mechanical withdrawal threshold) of left hind paw in rats were tested. On the 7th , 14th and 28th days after surgery, rats in the two groups underwent cardiac perfusion of 4% paraformaldehyde, then the L5spinal segments were dissected to prepare paraffin sections. GABAergic neurons were labeled by immunohistochemical staining of GABA neurotransmitters in cytoplasm. The quantitative analysis of stereological morphometry was used to describe the proportions of GABAergic neurons in the two groups. ResultsThe proportions of GABAergic neurons in the left spinal dorsal horn of group S on the 7th, 14th and 28th days after surgery were 60.41%±8.49%, 55.27%±6.80% and 61.87%±8.12%, respectively, and in the right spinal dorsal horn of group S were 61.94%±11.04%, 64.68%±9.77% and 62.58%±4.25%. On the same way, the proportions of GABAergic neurons in the left spinal dorsal horn of group D on the 7th, 14th and 28th days after surgery were 61.27%±8.73%, 63.59%±5.97% and 62.81%±10.26%, respectively, and in the right spinal dorsal horn of group D were 58.02%±4.58%, 60.84%±8.28% and 63.74%±10.88%. Compared with the right SDH of the same group and left SDH of group D, there were statistically significant reductions in the proportions of GABAergic neurons of the left SDH on 14th day after SNI in the group S (all P<0.05).ConclusionSNI model may lead to the decrease of the proportions of GABAergic neurons in SDH of damaged side, but this change does not last long. The transformation of GABAergic neurons may be related to mechanical hypersensitivity

Key words:neuropathic pain; mechanical pain threshold; GABAergic neurons; spinal cord dorsal horn; stereology

收稿日期：(2015-08-12)

通信作者簡介：劉洋(1969-)，男，博士，教授，主要研究方向為神經(jīng)病理性疼痛基礎(chǔ)與臨床。E-mail: phoenixylly@sina.com.cn

作者簡介：第一陳朝輝(1976-),男,碩士,副教授，主要研究方向為神經(jīng)病理性疼痛機制。E-mail: 563504740@qq.com

基金項目：川北醫(yī)學(xué)院科研發(fā)展計劃項目(CBY12-A-ZP04)。

中圖分類號：R441.1

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)47-0010-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.004