人腦膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白的表達(dá)變化及其意義

王明國，王向鵬，楊智勇，段奎甲，宋曉斌，鄧興力

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

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人腦膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白的表達(dá)變化及其意義

王明國，王向鵬，楊智勇，段奎甲，宋曉斌，鄧興力

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

摘要：目的觀察人腦膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測59例份人腦膠質(zhì)瘤組織，5例份正常腦組織中的ABCG2蛋白，并分析其與腦膠質(zhì)瘤患者年齡、性別、病理分級、腫瘤部位臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果人腦膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白陽性細(xì)胞百分比為19.27%±16.80%，正常人腦組織為0，兩者比較，P<0.05。WHO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級人腦膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白陽性細(xì)胞百分比分別為6.40%±2.77%、11.13%±8.69%、17.25%±10.90%、31.94%±20.32%，WHO Ⅲ、Ⅳ級與WHO Ⅰ、Ⅱ 級比較，P<0.05。年齡≤45歲、>45歲者ABCG2蛋白陽性細(xì)胞百分比分別為15.02%±12.07%、25.06%±20.52%，兩者比較，P<0.05。結(jié)論 ABCG2蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤病理分級、年齡有關(guān)，可能有助于判斷膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為、預(yù)后、化療效果。

關(guān)鍵詞：腦腫瘤；膠質(zhì)瘤；ABCG2蛋白

腦膠質(zhì)瘤多呈高度浸潤性生長，預(yù)后較差，極易復(fù)發(fā)。手術(shù)仍是腦膠質(zhì)瘤最主要的治療方式，術(shù)后常需輔助化療，但隨著腫瘤多藥耐藥性(MDR)的出現(xiàn)，化療藥物作用的敏感性降低，而化療抵抗是引起患者預(yù)后不良的重要因素之一[1,2]。因此，探索膠質(zhì)瘤MDR的相關(guān)作用機(jī)制及其有效逆轉(zhuǎn)策略成為腦腫瘤研究的熱點[3]。研究發(fā)現(xiàn)，ABCG2在多種耐藥腫瘤細(xì)胞株中過度表達(dá)，提示ABCG2作為一種半分子轉(zhuǎn)運蛋白，在腫瘤化療的多藥耐藥中具有重要作用。本研究觀察了人膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義。

1材料與方法

1.1組織標(biāo)本人膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本來自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2014年6月～2015年6月手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷確定的59例份膠質(zhì)瘤組織，標(biāo)本收集前均經(jīng)患者及家屬同意，術(shù)前均未行任何其他輔助治療。59例患者中男28例、女31例，年齡14～77歲、中位年齡46歲。WHO病理分級Ⅰ級11例、Ⅱ級9例、Ⅲ級19例、Ⅳ級20例。另收集取自本科室各種手術(shù)入路及手術(shù)減壓術(shù)中切除的正常腦組織標(biāo)本5例份作為對照。

1.2主要試劑小鼠抗人ABCG2單克隆抗體(美國abcam公司)；Super Vision超敏兩步法免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程公司)。

1.3ABCG2蛋白檢測方法采用免疫組化染色法。所有組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后作5 μm厚組織切片。組織切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化，并進(jìn)行抗原熱修復(fù)，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，5% BSA封閉后，滴加稀釋好的ABCG2于4 ℃孵育過夜，次日用PBS漂洗數(shù)次后，滴加聚合HRP標(biāo)記IgG。DAB試劑盒顯色5～10 min(光學(xué)顯微鏡下控制顯色程度)，脫水、透明、封片后觀察。PBS代替一抗作空白對照。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：ABCG2主要表達(dá)于細(xì)胞膜，部分表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，染成棕褐色。于低倍光學(xué)顯微鏡下(×100)尋找細(xì)胞陽性區(qū)域后，在高倍鏡(×400)下分別計數(shù)隨機(jī)5個視野中的平均陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，以平均陽性細(xì)胞數(shù)與平均細(xì)胞總數(shù)的比值百分比計算ABCG2蛋白陽性細(xì)胞百分比。

2結(jié)果

人腦膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白陽性細(xì)胞百分比為19.27%±16.80%，正常人腦組織為0，兩者比較，P<0.05。ABCG2陽性細(xì)胞在腦膠質(zhì)瘤中呈非均勻分布，部分區(qū)域可見陽性細(xì)胞密度較高，聚集分布，陽性細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，大小不一致，有時可見陽性細(xì)胞成條索狀排列、類似毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)。ABCG2蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。WHO Ⅲ、Ⅳ級較WHO Ⅰ、Ⅱ級人腦膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白陽性細(xì)胞百分比高(P<0.05)。年齡>45歲者較年齡≤45歲者ABCG2蛋白陽性細(xì)胞百分比高(P<0.05)。

表1　 ABCG2蛋白表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤臨床病理

3討論

惡性膠質(zhì)瘤是我國最常見的腦腫瘤之一，其預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。目前手術(shù)仍是其最主要的治療方式，結(jié)合分子靶向治療及同步放化療的綜合治療策略在膠質(zhì)瘤的診療中顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢[4,5]。然而腫瘤的化療耐藥限制了惡性腫瘤患者的首次治療效果，一線治療方案失敗后的補(bǔ)救治療效果亦很差[6,7]。與其他各部位腫瘤化療一樣，腫瘤細(xì)胞對抗癌化療藥物的多藥耐藥是腦惡性腫瘤化療效果差的最重要原因。

Zhou等[8]報道，ABCG2基因可以作為一種通用的干細(xì)胞鑒定標(biāo)志物。且已有大量研究表明，在腫瘤組織中也存在著腫瘤干細(xì)胞并攜有ABCG2半轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，相關(guān)ABCG2半轉(zhuǎn)運體在腫瘤干細(xì)胞中的生物學(xué)功效研究已成為近年癌癥治療研究中的熱點問題[9]。研究主要集中于ABCG2腫瘤干細(xì)胞的分選功能及其多藥耐藥功能[10,11]。將該基因轉(zhuǎn)染非耐藥的乳腺癌細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得了與耐藥細(xì)胞株MCF-7/AdrVp相似的耐藥特征，對甲氨蝶呤、米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素拓?fù)涮婵导捌浒牒铣晌锬退嶽3,12]。腫瘤干細(xì)胞或腫瘤中的側(cè)群細(xì)胞因表達(dá)ABCG2而產(chǎn)生耐藥的生物學(xué)特性，導(dǎo)致術(shù)后化療效果極差，是惡性腫瘤難以根除的原因之一[13]．

本研究結(jié)果顯示，正常人腦組織中未見ABCG2蛋白表達(dá)，而在各分級膠質(zhì)瘤組織中均有不同程度的表達(dá)，且病理分級WHO Ⅲ、Ⅳ級較WHO Ⅰ、Ⅱ級人腦膠質(zhì)瘤組織中ABCG2蛋白陽性細(xì)胞百分比高。而只有處于干細(xì)胞階段的細(xì)胞才表達(dá)ABCG2，提示病理分級高的膠質(zhì)瘤組織存在更多的腦腫瘤干細(xì)胞，其臨床侵襲性更高，患者出現(xiàn)化療耐藥的可能性較大，與儲亮等[14]的研究結(jié)果一致。在本研究中，ABCG2免疫陽性細(xì)胞呈條索狀排列，部分區(qū)域可見陽性細(xì)胞密度較高，聚集分布。提示腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生可能是以少數(shù)的腦腫瘤干細(xì)胞為生發(fā)根源，逐漸增殖分化并向臨近微環(huán)境遷移整合，歷經(jīng)此生物學(xué)過程，大量腦腫瘤干細(xì)胞分化成腫瘤細(xì)胞，僅少數(shù)細(xì)胞仍保持其干細(xì)胞特性。術(shù)后殘存的腫瘤干細(xì)胞可通過自我更新及多分化潛能，在人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、耐藥過程中起關(guān)鍵作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)瘤中ABCG2的表達(dá)與患者的性別、腫瘤生長部位無關(guān)，而與患者的年齡密切相關(guān)，提示ABCG2的高表達(dá)可能源于細(xì)胞基因突變在腦腫瘤干細(xì)胞內(nèi)的長期積累。以上研究結(jié)果提示，腦腫瘤干細(xì)胞使腫瘤具有對周圍腦組織的侵潤能力和對放化療的抵抗性，是腦膠質(zhì)瘤高致死率和高復(fù)發(fā)率的根源。

相關(guān)研究[15]結(jié)果表明，黑色素瘤細(xì)胞中ABCG2的異常表達(dá)是細(xì)胞對Vemurafenib出現(xiàn)耐藥的重要分子機(jī)制之一，在人黑色素瘤A375細(xì)胞中敲低ABCG2可顯著改善Vemurafenib的藥物敏感性，證實ABCG2異常表達(dá)是機(jī)體對靶向藥物產(chǎn)生耐藥反應(yīng)的重要分子機(jī)制之一。因此，有可能通過干預(yù)ABCG2在腫瘤干細(xì)胞中的表達(dá)來調(diào)控腫瘤干細(xì)胞增殖分化從而達(dá)到治愈癌癥的目的。ABC轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑能夠增加化療藥物在腦內(nèi)的積累。gefitinib的口服給藥能夠增加topotecan在神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤中的藥物濃度。這些研究都說明了通過抑制ABC跨膜轉(zhuǎn)運蛋白,能夠增高ABC轉(zhuǎn)運蛋白底物譜中的藥物穿過血腦屏障的概率,增加這些藥物在神經(jīng)系統(tǒng)的積累,可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16]。

綜上所述，人膠質(zhì)瘤組織ABCG2蛋白表達(dá)增高，其表達(dá)與腫瘤病理分級、年齡有關(guān)。深入探究ABCG2的表達(dá)與腫瘤MDR及與腫瘤干細(xì)胞分化調(diào)控的相關(guān)作用機(jī)制[17]，將會對尋找新的癌癥治療策略提供新思路。ABCG2蛋白可能有助于判斷膠質(zhì)瘤生物學(xué)行為、預(yù)后、化療效果，并可作為生物靶向治療的有效靶點。

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收稿日期：(2015-11-02)

通信作者：鄧興力

基金項目：云南省自然科學(xué)基金(2007C244M)；云南省衛(wèi)生廳科研 (2012ws0024)。

中圖分類號：R739.41

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1002-266X(2015)47-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.014