肢體缺血預(yù)處理對大鼠腦缺血后海馬的保護作用機制研究進展

梁辰，初海平，王福文

(1山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，濟南 250062；2濟南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院；3山東省罕少見病重點實驗室)

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肢體缺血預(yù)處理對大鼠腦缺血后海馬的保護作用機制研究進展

梁辰1,2，初海平1,3，王福文1,3

(1山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，濟南 250062；2濟南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院；3山東省罕少見病重點實驗室)

摘要：缺血性腦血管疾病時海馬損傷最為嚴重，肢體缺血預(yù)處理(LIP)可以積極地緩解腦缺血引起的海馬損傷，主要通過抑制自由基毒性、抑制炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)信號傳導(dǎo)通路、誘導(dǎo)基因表達等機制發(fā)揮保護作用，亦能通過促進熱休克蛋白Hsp70表達和干細胞的增殖，以及激活阿片受體和線粒體ATP敏感性鉀通道減輕海馬損傷。

關(guān)鍵詞：肢體缺血預(yù)處理；缺血性腦血管疾病；腦缺血；海馬損傷

目前，缺血性腦血管病的發(fā)病率不斷升高，其中海馬損傷最為嚴重，迅速恢復(fù)腦血流量是其首要的治療措施。然而大量研究表明，缺血后再灌注可加重缺血組織或器官損傷。因此，臨床上如何防止缺血再灌注損傷是目前亟待解決的問題。Kitagawa等[1]發(fā)現(xiàn)，對沙鼠腦缺血模型進行腦缺血預(yù)處理(CIP)可對缺血5 min的海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元起到明顯的保護作用。與此類似的許多其他同一器官的缺血預(yù)處理也證實具有良好的預(yù)防效果。然而這種方法也存在一些弊端，如預(yù)處理程度難掌控、操作復(fù)雜等。遠隔器官的缺血預(yù)處理就是對缺血損傷的主要器官以外的器官進行程度較小的缺血/再灌注處理，這種使用非重要生命器官預(yù)缺血處理對抗心、腦等重要器官缺血再灌注損傷的方法[2]為臨床治療疾病提供了新的方法和思路。有文獻報道，肢體、小腸以及腎臟等遠隔器官的短暫缺血等均對缺血后腦海馬區(qū)椎體神經(jīng)元有保護作用。肢體缺血預(yù)處理(LIP)通過對肢體的周期性缺血/再灌注的方法間接治療或減輕腦損傷，尤其對海馬區(qū)神經(jīng)纖維具有良好的保護作用[3]，但其機制尚不清楚，研究較多的有抑制自由基毒性、抑制炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)信號傳導(dǎo)通路等。現(xiàn)就LIP對大鼠腦缺血后海馬的保護作用機制研究進展進行綜述。

1抑制自由基毒性

2抑制炎癥反應(yīng)

腦缺血/再灌注時伴隨著局部過度炎癥反應(yīng)，是造成海馬區(qū)損傷的主要原因之一，許多炎癥細胞和炎癥介質(zhì)參與了炎癥反應(yīng)。炎癥細胞包括白細胞、小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞，其中白細胞是造成神經(jīng)損傷的主要炎癥細胞。以往的研究表明，腦缺血后，白細胞黏附在腦血管壁上會加劇腦水腫的形成[8]，白細胞的積累還會刺激氧自由基和蛋白水解酶的釋放[9,10]，同時腦缺血再灌注后，浸潤的炎癥細胞會產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)細胞因子、趨化因子和黏附分子等，進而促進白細胞黏附并浸潤內(nèi)皮細胞，進一步加重海馬區(qū)神經(jīng)元損傷。Yannopoulos等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對豬雙前肢缺血預(yù)處理后，能夠提高線粒體還原型輔酶Ⅰ(NADH)含量，增強線粒體呼吸鏈功能，明顯減少白細胞數(shù)目。炎癥反應(yīng)可以激活血管內(nèi)皮細胞、血小板、免疫細胞釋放大量細胞因子IL、THF-α等。這些細胞因子又反過來促進了炎癥反應(yīng)，增加興奮性氨基酸、NO、氧自由基的釋放等加重海馬損傷。IL-6參與機體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，其含量迅速增高可加劇神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞及內(nèi)皮因子損傷，是衡量海馬損傷程度的一個重要標志。Wang等[12]研究表明，LIP后MCAO的SD大鼠較單純MCAO大鼠海馬CA1區(qū)IL-6和IL-17表達水平顯著減少，提示抗炎作用可以減少海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡。

3介導(dǎo)信號傳導(dǎo)通路

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一組能被不同的細胞外刺激(細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞應(yīng)激及細胞黏附等)激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，可調(diào)節(jié)包括新陳代謝、細胞活力、細胞炎癥、細胞的壞死和凋亡等一系列的細胞活動。Zhao[13]研究發(fā)現(xiàn)，早期的缺血預(yù)處理可以保護心肌和腦急性缺血再灌注引起的損傷，其保護機制與MAPK有關(guān)。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)是MAPK家族的重要成員，參與海馬區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡過程，但其作用說法不一，Ansar等[14]研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2抑制劑能夠降低血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和血栓素(TP)的含量，抵抗由腦缺血引起的血管收縮，進而防止神經(jīng)損傷。姜紅升等[15]使用Western blotting法檢測不同時長腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)ERK1/2含量，結(jié)果表明，各時間點LIP組ERK1/2水平均高于腦缺血/再灌注組，同時焦油紫染色結(jié)果顯示，LIP組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量較腦缺血/再灌注組明顯增加，而給予ERK1/2上游激酶抑制劑PD98059后，神經(jīng)元數(shù)量較LIP組大幅下降，這表明LIP可通過激活ERK1/2通路減輕大鼠海馬CA1區(qū)缺血性神經(jīng)元損傷。但Maddahi等[16]研究表明，ERK1/2通過上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子擴大炎癥反應(yīng)，加重缺血區(qū)神經(jīng)損傷。

磷脂酰肌醇激酶-3/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是膜受體信號向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，在心臟、腎臟、肝臟等多種器官缺血再灌注損傷中發(fā)揮抑制細胞凋亡作用。PI3K通過3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)磷酸化AKT使其活性增強，影響下游凋亡相關(guān)蛋白如GSK-3β、BAD、FKHR、CaMKⅡ等，發(fā)揮抗凋亡的作用[17]。Peng等[18]研究表明，LIP通過PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑上調(diào)eNOS減輕海馬CA1區(qū)神經(jīng)損傷，eNOS抑制劑N(ω)-硝基-L-精氨酸甲酯能顯著廢除LIP的神經(jīng)保護作用，而PI3K的高度選擇性抑制劑LY294002不僅能顯著逆轉(zhuǎn)LIP的神經(jīng)保護作用，也能明顯抑制LIP誘導(dǎo)的eNOS上調(diào)。JAK/STAT是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及神經(jīng)細胞的增殖、生存、分化過程，并與腦腫瘤、腦缺血等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程密切相關(guān)。腦缺血后，STAT3過度活化能促進神經(jīng)細胞死亡，加重腦損傷。Cheng等[19]研究表明，LIP可以通過下調(diào)STAT3減少TNF-α和核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的表達減輕海馬損傷。

4誘導(dǎo)基因表達

腦缺血可誘導(dǎo)某些基因的表達，這些基因的表達可能有助于缺血后神經(jīng)元損傷的恢復(fù)。LIP可增加這些基因的表達, 減輕腦缺血再灌注損傷。原癌基因c-fos是一種即刻早期基因(IEGs)，其蛋白產(chǎn)物Fos蛋白常被用作神經(jīng)元功能活動的標記物。CIP可促進c-fos的表達[20]。海馬CA1區(qū)c-fos表達弱且延遲，甚至出現(xiàn)只有c-fos的mRNA，但無Fos蛋白翻譯的情況，提示c-fos早期表達對促進缺血后細胞的存活具有重要作用，LIP可增強損傷性腦缺血后c-fos在海馬CA1區(qū)的表達[21]。

有研究[22]表明，p63基因的表達對腦缺血后神經(jīng)損傷有保護作用，可能參與腦缺血后神經(jīng)細胞損傷的凋亡過程。Lee等[23]研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血處理后，海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元p63表達明顯高于假手術(shù)組，提示p63可能是調(diào)控腦缺血后神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵基因。廖常莉等[24]使用免疫組化法分析表明，LIP處理后的大鼠海馬CA1區(qū)p63基因表達低于缺血/再灌注組，且HE染色結(jié)果顯示LIP處理后神經(jīng)凋亡減弱，表明LIP對海馬區(qū)神經(jīng)元的保護作用可能與下調(diào)p63基因的表達有關(guān)。

5促進Hsp70蛋白表達

Hsp是在缺血、缺氧等應(yīng)激因素作用下，機體大量合成的一組蛋白，與缺血性腦損傷等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病關(guān)系密切，按其相對分子質(zhì)量大小主要分為Hsp27、Hsp70、Hsp90等，其中Hsp70家族研究最為廣泛。Hsp70作為腦缺血誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種神經(jīng)元保護性物質(zhì)，可阻止蛋白質(zhì)在壓力下發(fā)生聚集或錯誤的折疊，被認為與缺血性腦損傷的修復(fù)密切相關(guān)，是預(yù)示受損神經(jīng)元能夠存活的一個敏感指標。Sun等[25]研究表明，Hsp70參與腦缺血后海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元的保護作用。Sun等[26]使用Western blotting和免疫組化檢測LIP處理后的大鼠，發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)Hsp70蓄積增多，腹腔注射Hsp抑制劑SB 203580后，LIP對海馬CA1區(qū)腦損傷的保護作用減弱。以上研究表明，Hsp70作為一種內(nèi)源性保護蛋白，參與LIP誘導(dǎo)腦缺血耐受的產(chǎn)生，腦缺血后海馬區(qū)神經(jīng)細胞的最終死亡可能與Hsp70合成障礙有關(guān)，Hsp70的表達上調(diào)是LIP誘導(dǎo)缺血耐受的重要分子機制之一。

6促進神經(jīng)干細胞(NSC)增殖

NSC是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以增殖、遷移、分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的一類具有代償功能的細胞，人腦海馬的齒狀回是NSC的主要存在部位。巢蛋白(Nestin)的表達伴隨NSC分裂分化的始終，隨著神經(jīng)分化完成而終止，為NSC的特征性標志物。這是因為Nestin是一種中間絲類型的蛋白，能夠在NSC特異性表達，因此可以通過檢測Nestin的含量評價神經(jīng)損傷的治療效果[27]。張永輝等[28]采用免疫組化法檢測LIP后的大鼠海馬中心區(qū)冠狀腦切片，發(fā)現(xiàn)其Nestin陽性細胞明顯多于假手術(shù)組，表明較輕程度遠隔肢體缺血能引起NSC增殖，從而提高腦梗死后的局部應(yīng)激能力，加速腦內(nèi)NSC的增殖，保護腦組織損傷。

7激活阿片受體和線粒體ATP敏感性鉀通道

阿片受體廣泛分布于腦、脊髓、外周感覺神經(jīng)元及外周自主神經(jīng)元，在海馬區(qū)分布也相當廣泛，阿片受體同樣分布在上下肢等其他遠隔器官，LIP對海馬區(qū)神經(jīng)細胞的保護作用可能與介導(dǎo)阿片受體有關(guān)。2011年，Zhou等[29]研究表明，阿片受體拮抗劑納洛酮削弱了LIP后腦梗死面積減少的保護作用，另外，Akt信號通路被渥曼青霉素阻斷后同樣抑制該保護作用，由此得出結(jié)論，LIP可以通過激活阿片受體和Akt信號通路來保護腦缺血造成的神經(jīng)損傷。許多研究[30]證實，線粒體ATP敏感性鉀通道(mito KATP)參與了κ-阿片受體介導(dǎo)的心肌保護作用。mito KATP在缺血預(yù)處理中的作用已得到肯定，在神經(jīng)元的缺血/再灌注損傷中具有非常重要的地位。研究[31]表明，mito KATP阻斷劑5-HD能消除LIP的神經(jīng)保護作用。Sun等[32]對大鼠雙側(cè)股動脈閉塞/再灌注5個周期后發(fā)現(xiàn)，大鼠腦梗死面積明顯減少，海馬區(qū)神經(jīng)細胞損傷減弱，而使用mito KATP拮抗劑后該保護作用明顯減弱。以上研究表明，LIP可以通過增強mito KATP活性保護海馬區(qū)神經(jīng)細胞。

LIP能夠通過抑制自由基毒性、抑制炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)信號傳導(dǎo)通路、誘導(dǎo)基因表達等機制發(fā)揮保護作用，亦能通過促進熱休克蛋白Hsp70表達和干細胞的增殖，以及激活阿片受體和線粒體ATP敏感性鉀通道減輕海馬損傷。LIP通過腦缺血耐受而調(diào)動內(nèi)源性保護機制，延長缺血性腦血管病的治療時間窗，進而防治缺血性腦血管病，其具體病理生理機制尚在研究中，許多內(nèi)源性神經(jīng)保護因子或介質(zhì)參與缺血預(yù)處理的細胞保護作用，其中與早期保護有關(guān)的物質(zhì)包括乙酰膽堿、兒茶酚胺、AngⅡ、緩激肽、阿片肽等，與延遲保護有關(guān)的有腺苷、氧自由基和NO等，即刻早期基因在LIP也發(fā)揮重要的作用以及其他機制[33,34]等。LIP實施方便，方法簡單，對人體的損傷微小，具有很高的臨床應(yīng)用價值。此外，LIP配合藥物治療效果會大大增加，Burda等[35]研究表明，注射紅藻氨酸后大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量由單純LIP的15.87%上升為42.8%。因此，藥物聯(lián)合治療缺血性腦血管疾病將成為未來發(fā)展的方向。

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收稿日期：(2015-07-03)

通信作者：王福文

基金項目：國家科技重大專項子課題(2009ZX09301-013)。

中圖分類號：R96;R971

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)47-0101-04

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.47.040