異常黑膽質成熟劑對抑郁癥模型大鼠海馬細胞外信號調控激酶信號轉導通路的影響

異常黑膽質成熟劑對抑郁癥模型大鼠海馬細胞外信號調控激酶信號轉導通路的影響

哈力旦木·吾加不都1， 古孜力努爾·依馬木1， 阿不都熱衣木·肉孜2，

吐爾遜怕夏·吾布力卡斯木1， 阿不都熱依木·玉蘇甫1

(新疆醫科大學1維吾爾醫學院;2新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所， 烏魯木齊830011)

摘要:目的探討異常黑膽質成熟劑對抑郁癥模型大鼠大腦細胞外信號調控激酶信號轉導通路(ERK)的影響。方法選取Sprague-Dawley雄性大鼠84只，隨機分為6組：正常對照組、陽性對照組、抑郁癥模型組及異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組(ASMq低、中、高 分別為1.5、3.0、6.0 g·kg-1·d-1，連續給藥4 w)，每組14只。除正常對照組外，其余各組均采用輕度不可預見性慢性應激刺激(Chronic mild unp redictable stress,CMUS)建立抑郁癥大鼠模型，通過體質量測量、糖水攝取量綜合評價大鼠行為學改變，在對ERK信號轉導通路中Ras和RSK蛋白表達水平測量的基礎上，采用重復測量和單因素方差分析方法，揭示異常黑膽質成熟劑的抗抑郁作用。結果與正常對照組比較，抑郁癥模型組體質量增幅明顯降低(P<0.05)，糖水攝入量顯著降低(P<0.05)，差異均有統計學意義。與正常對照組比較，抑郁癥模型組大鼠海馬Ras和RSK蛋白表達顯著降低(P<0.05)，與抑郁癥模型組比較，異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組與陽性對照組海馬Ras和RSK蛋白表達顯著升高(P<0.05)，差異均有統計學意義。結論異常黑膽質成熟劑可能通過上調Ras/RSK/ERK信號轉導通路起到抗抑郁作用。

關鍵詞：異常黑膽質成熟劑； 抑郁癥； ERK； Ras； RSK

中圖分類號：R749.92； R29文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.006

[收稿日期：2014-11-02]

基金項目：科技部國際合作項目(2012DFA31560)

作者簡介：李亞偉(1990-)，女，在讀碩士，研究方向：腫瘤放射治療臨床應用研究。

Effects of Abnormal Savda Munziq on hippocampal extracellular signal-regulated

kinase signal transduction pathway of depression model rats

Halida Gojabdul1, Guzalnur Imam1, Abdiriyim Rozi2, Tursunpaxa Ubulkasim1, Abdiriyim Yusup1

(1CollegeoftraditionalUyghurMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;

2AutonomousRegionInstituteofUhghurMedicine,Urumqi830011,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of abnormal savda munziq on hippocampal Extracellular signal-regulated kinase signal transduction pathway of Depression model rats. Methods84 male SD rats were randomly divided into normal control group, the positive control group, abnormal savda munziq low, medium and high dose groups (respectively 1.5, 3.0, 6.0 g·kg-1·d-1), depression model group, roughly 14 in each group. The normal control group excluded, unpredictable mild chronic stressors (Chronic mild unpredictable stress, CMUS) was used to determine rat model of depression in the other groups. The body mass, sugar intake were measured to evaluate behavioral changes in rats. On the basis of the ERK signal transduction pathway RAS / RSK protein expression, RM (Repeated Measurements) and ANOVA (Single Factor Analysis of Variance method) were used to explore the antidepressant effect of abnormal savda Munziq. ResultsCompared with the control group, the depression model group had a significantly-decreased weight gain and sucrose intake (P<0.05); Compared with normal control group, depression model group showed a significant reduction in hippocampal and RSK Ras protein expression (P<0.05) ; Compared with those in depression model group, hippocampal and RSK Ras protein expression increased significantly in the abnormal savda Munziq low, medium, high dose groups and positive control group, having statistical significance (P>0.05). ConclusionAbnormal Savda Munziq (ASMq) may play an antidepressant role by improving Ras/RSK/ERK Signal Transduction Pathway.

Key words: Abnormal Savda Munziq; Depression; ERK; Ras; RSK

隨著現代社會的發展，人們的生活節奏越來越快，競爭越來越激烈，精神健康的問題已經不可避免地出現，而抑郁癥就是其中之一[1]。近年來，隨著分子生物學技術的深入研究，發現抑郁癥的發病與信號通路有一定相關性[2]。絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)對神經前提細胞的生成、神經脊的形成和發育、突觸信號傳遞及意識、學習和記憶能力的形成有重要作用，因此認為其是目前與抑郁癥發病最為相關的信號通路。細胞胞外信號調控激酶(ERK)是MAPK中最重要、最為經典的信號轉導途徑之一[3]，其大部分是Ras(rat sarcoma,Ras)依賴途徑，具有調節神經信號轉導的特性，并且被認為是大多數信號通路的重要整合點。Ras是一種原癌基因ras表達的蛋白質，控制MAPK激酶鏈，被稱為控制生長和分化的信號途徑的分子開關[4]。生長因子等多種細胞外刺激信號作用于細胞表面受體，活化細胞內的Ras，啟動下游的ERK1/2激酶。核糖體S60蛋白激酶是ERK1/2下游激酶之一[5]，參與多種細胞生命活動的調節，如蛋白質合成、基因表達、細胞生存和分化以及學習和記憶等[6-7]，其通過上游轉導因子的磷酸活化起到調節作用?；谝陨险撌?，本研究取與情緒調節有關的腦區(海馬)作為研究樣本，采用Western blot蛋白印跡法對ERK信號通路的上、下游轉導因子(Ras、RSK)進行檢測，以期發現異常黑膽質成熟劑抗抑郁的可能作用途徑。

1材料與方法

1.1動物分組采用健康雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠84只，體質量180～220 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。所有大鼠在室溫18℃～22℃、無噪音、自然晝夜戒律光照下1 w 后，隨機分為異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組及抑郁癥模型組、陽性對照組(鹽酸氟西汀)、正常對照組共6組，每組14只。大鼠均單籠飼養。

1.2藥材、試劑及儀器異常黑膽質成熟劑由新疆奇康哈博維藥有限公司生產(批號：121011)，鹽酸氟西汀膠囊由上海中西制藥有限公司生產。BCA蛋白定量試劑盒，Western blot 試劑盒。STE-2型脫色搖床(上海琪特分析儀器有限公司)，高速冷凍離心機，電泳儀，電子天平、電熱恒溫干燥箱，超低溫冰箱。

1.3方法

1.3.1造模及給藥進行28 d慢性輕度不可預見性應激刺激后(CMUS)，電擊足底(40ⅴ電壓，每隔1 min電擊1次，每次持續10 s)，冰水游泳(4 ℃，5 min)，搖晃(1次/s，3 min)，夾尾1 min，禁水24 h，禁食24 h，晝夜顛倒，每天隨機安排1種，平均每種刺激給予3次。所有動物正常飼養1 w后，從給予應激當天開始除正常對照組和抑郁癥模型組外，異常黑膽質成熟劑高劑量組(異黑高)每日經口灌胃1次異常黑膽質成熟劑6.0 g/kg，異常黑膽質成熟劑中劑量組(異黑中)每日經口灌胃1次異常黑膽質成熟劑3.0 g/kg，異常黑膽質成熟劑低劑量組(異黑低)每日經口灌胃1次異常黑膽質成熟劑1.5 g/kg，陽性對照組每日經口灌胃1次鹽酸氟西汀膠囊3.5 mg/kg。

1.3.2體質量測量從飼養動物第1天開始每隔1 周測量各組大鼠體質量，計算并比較各組大鼠體質量增加量。

1.3.3糖水攝入量實驗前48 h，訓練大鼠適應1%蔗糖水，然后斷水12 h，測晚間2 h內糖水攝入量，在實驗第28天，再次測量糖水攝入量。

1.4指標檢測各組大鼠末次給藥1 h后，斷頭處死，同時在冰上分離海馬。用加有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解組織提取蛋白。10%～12%SDS-PAGE凝膠60 mA電泳40 min,300 mA轉膜2 h，1.5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次/10 min，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次/10 min，顯色，用Image J2x進行條帶分析。

1.5統計學處理采用SPSS17.0軟件進行數據分析。計量資料數據采用均數±標準差(±s)表示。體質量改變、糖水攝取量采用重復測量的方差分析。蛋白表達水平采用計量資料單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1行為學改變

2.1.1各組大鼠體質量改變各組大鼠應激前體質量差異無統計學意義(P>0.05)；實驗處理第28天，正常對照組的體質量與抑郁癥模型組大鼠的體質量差異有統計學意義(P<0.05)；陽性對照組及異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組與抑郁癥模型組大鼠體質量差異有統計學意義(P<0.05)；而陽性對照組與異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組體質量差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1　各組大鼠體質量表(g， ±s)

表1　各組大鼠體質量表(g， ±s)

組別動物數/只第1周第2周第3周第4周第5周正常對照組14244.35±31.35316.14±36.63*342.57±34.66*338.00±35.51*316.14±48.83*陽性對照組14240.07±22.38264.28±26.10301.71±22.39315.71±21.92283.28±21.98抑郁癥模型組14237.92±21.61266.78±29.44291.57±26.26275.71±22.39263.78±22.71常黑膽質高劑量組14241.92±28.80285.21±32.61303.78±35.37281.07±24.39279.57±26.90異常黑膽質中劑量組14236.14±22.09296.57±26.66*293.92±25.85*293.07±24.39280.00±25.15*異常黑膽質低劑量組14240.64±26.33301.42±23.92*307.57±29.61*298.21±30.26*300.42±26.45*

注：與抑郁癥模型組比較，*P<0.05。

2.1.2各組大鼠糖水攝取量應激前各組大鼠糖水攝取量差異無統計學意義(P>0.05)。應激第28 天后正常對照組與抑郁癥模型組糖水攝取量差異有統計學意義，同時陽性對照組及異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組糖水攝入量明顯高于抑郁癥模型組，差異有統計學意義(P<0.05)，而陽性對照組與異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組差異無統計學意義，見表2。

2.2各組大鼠海馬組織中的Ras、RSK蛋白表達水平利用western blot法檢測各組大鼠海馬Ras、RSK蛋白的表達水平，結果顯示：與正常對照組比較，抑郁癥模型組大鼠海馬組織中的Ras、RSK蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與抑郁癥模型組比較，異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組及陽性對照組大鼠海馬組織中的Ras、RSK蛋白表達水平顯著升高。與抑郁癥模型組比較，異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組與陽性對照組大鼠海馬組織中的Ras、RSK蛋白條帶明顯強于抑郁癥模型組標本； 與陽性對照組比較， 異常黑膽質成熟劑低、中、高劑量組差異無統計學意義(P>0.05)，見表3和圖1、2。

表2　各組大鼠糖水攝取量(mL, ±s)

表2　各組大鼠糖水攝取量(mL, ±s)

組別動物數/只應激前應激后正常對照組14173.0±7.07186.5±12.02*陽性對照組14158.0±8.48168.5±14.84抑郁癥模型組14161.0±8.4899.0±2.82異常黑膽質高劑量組14162.0±7.07171.0±7.07*異常黑膽質中劑量組14141.0±8.48170.0±22.62*異常黑膽質低劑量組14157.8±11.62160.5±20.50*

注：與抑郁癥模型組比較， *P<0.05。

表3　各組大鼠海馬組織中的Ras,RSK蛋白表達水平( ±s)

注：與抑郁癥模型組比較， *P<0.05。

組別劑量/(g·kg-1·d-1)RasRSK?正常對照組-168.51±39.95*86.43±17.52*陽性對照組-95.03±43.67*90.05±25.43*抑郁癥模型組-51.76±30.5741.05±22.28異常黑膽質高劑量組6.091.48±40.39*85.27±8.08*異常黑膽質中劑量組3.0201.65±42.8*88.74±24.10*異常黑膽質低劑量組1.5192.20±48.37*83.04±25.30*

注：與抑郁癥模型組比較，*P<0.05。

圖1westeren blotting 分析異常黑膽質成熟劑對抑郁癥模型大鼠海馬Ras蛋白含量的影響

圖2westeren blotting 分析異常黑膽質成熟劑對抑郁癥模型大鼠海馬RSK蛋白含量的影響

3討論

抑郁癥的臨床表現中比較突出的是情緒低落、沒有興趣、悲觀,在這個情緒低落的基礎上，出現一些興趣喪失，有部分人還會出現思維緩慢、記憶力下降、食欲下降等。據中國心理衛生協會有關數據顯示，我國抑郁癥發病率為3%～5%，目前中國有病例記錄抑郁癥患者已超過3 000萬，但從未就醫率卻達62.9%，15%死于自殺。世界衛生組織預測，抑郁癥已經成為中國疾病負擔的第二大疾病[8]?？梢?，抑郁癥的嚴重影響必將引起社會的重視。

維吾爾醫學理論具有獨特的體液論，認為體液是在肝臟中形成，能被機體所轉化，為生命賦予力量，不斷生成，又不斷被利用[9]。正常體液分為膽液質、血液質、黏液質、黑膽質，其中黑膽質參與感覺、思維、記憶等活動。正常機體內，4種體液處于平衡狀態，但當機體受內外不良因素與環境的影響時，4種體液的動態平衡會被破壞，4種體液在質和量上發生改變，從而形成對機體有害的異常體液。異常體液分為異常膽液、異常血液質、異常黏液質、異常黑膽質，其中異常黑膽質體液分量重，質地稠，易沉淀，具有強刺激性和破壞性[10]。維吾爾醫學認為機體長期處在營養不良或長期遇到不良精神刺激時，機體內正常的黑膽質體液的量將會增加，最終導致黑膽質體液的凝結和沉淀，從而產生異常黑膽質型抑郁癥。近幾年維吾爾醫對抑郁癥的研究發現，抑郁癥在不同患者體液中的構成比有所差異，其中異常黑膽質型抑郁癥占52%，提示抑郁癥具有“同病異證”的特點，異常黑膽質證是抑郁癥的主要證型[11]。根據維吾爾醫“同病異證”的臨床治療原則，使用異常黑膽質成熟劑及其清除劑治療由異常黑膽質所導致的抑郁癥。

本課題組以往對異常黑膽質成熟劑抗抑郁癥的研究顯示異常黑膽質成熟劑可明顯加快慢性應激抑郁癥模型大鼠體質量增長的速度[12]，降低抑郁癥動物模型大鼠血清促腎上腺皮質激素(ACTH)、皮質醇(CORT)的含量，糾正下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)亢進，對下丘腦、垂體、腎上腺組織具有保護和修復功能；升高β-內啡肽(β-EP)、5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(AD)的含量而影響神經遞質；還可升高血液多巴胺(DA)、 腦源性神經營養因子(BDNF)的含量[13]而發揮作用。在分子水平上異常黑膽質成熟劑可提高( BDNF)、(5-HT)、mRNA在抑郁模型大鼠海馬中的表達[14]。本研究采用輕度的不可預見性慢性應激刺激誘導建立抑郁大鼠模型，結果顯示:抑郁癥模型大鼠行為學改變明顯，與對照組比較，抑郁癥模型組體質量增加幅度明顯減少(P<0.05)；與正常對照組比較，抑郁癥模型組的糖水攝入量明顯減少(P<0.05)，處于明顯的抑郁狀態，而服用異常黑膽質成熟劑與鹽酸氟西汀的對照組對行為學的異常改變有所糾正作用。Western blotting結果顯示，與正常對照組比較，抑郁癥模型組大鼠海馬RAS、RSK含量顯著升高(P<0.05)；與抑郁癥模型組比較，陽性對照組與異常黑膽質低、中、高劑量組大鼠海馬RAS,RSK含量顯著升高(P<0.05)；而正常對照組與異常黑膽質低、中劑量組比較差異有統計學意義(P<0.05)，與異常黑膽質高劑量組比較差異無統計學意義(P>0.05)，提示抑郁癥模型大鼠海馬內RAS/RSK/ERK信號通路顯著下降，異常黑膽質成熟劑可能具有上調RAS/RSK/ERK信號通路和有效改善抑郁癥模型大鼠抑郁狀態的作用，異常黑膽質具有抗抑郁療效。

綜上所述，采用輕度慢性不可預見性應激引起實驗動物海馬內RAS/RSK/ERK信號通路表達水平下降，給予異常黑膽質成熟劑使實驗動物海馬內RAS/RSK/ERK信號通路表達水平明顯升高，進一步揭示了異常黑膽質成熟劑具有治療抑郁癥的作用。陽性對照組與異常黑膽質低、中、高劑量組大鼠海馬內RAS/RSK/ERK信號通路表達水平均有升高，提示異常黑膽質成熟劑具有與目前在臨床上運用廣泛的抗抑郁藥療效相同的作用。鹽酸氟西汀是目前臨床上主要用于治療抑郁癥的藥物，其作用快、療效好，但毒副作用大，易產生耐藥性。維吾爾醫藥療效好，毒副作用小，不易產生耐藥性，異常黑膽質成熟劑抗抑郁作用的進一步證實滿足了抑郁癥患者對可靠性強、毒副作用小的抗抑郁藥物出現的期待。

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(本文編輯張巧蓮)

通信作者：王若崢，女，博士，教授，主任醫師，博士生導師，研究方向：腫瘤放射治療應用基礎和臨床應用，E-mail：wrz8526@163.com。

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