長治老年人群血漿同型半胱氨酸水平與MTHFR C677T基因多態性

長治老年人群血漿同型半胱氨酸水平與MTHFR C677T基因多態性

陳云霞程紅兵武延雋張雄鷹

(長治醫學院微生物學教研室，山西長治046000)

摘要〔〕目的探討長治地區健康老年人群血漿同型半胱氨酸(HCY)水平與N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T基因位點的基因多態性。方法采用酶聯免疫吸附法進行血漿HCY水平測定；采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性法(PCR-RFLP)對MTHFR C677T進行基因多態性分析。結果長治地區健康老年人群血漿HCY水平為(11.0±3.1)μmol/L，與健康青年人群相比，無統計學差異(P>0.05)。老年人群中MTHFR C677T基因的CC、CT和TT基因型頻率分別為15.38%、48.72%和35.90%，與青年人群相比，兩者差異無統計學性(P>0.05)；老年人群C、T等位基因頻率分別為39.74%和60.26%，與青年人群相比，兩者差異無統計學意義(P>0.05)。MTHFR C677T基因型頻率在長治地區健康老年人群、青年人群中均符合Hardy-Weinberg平衡。健康老年人群MTHFR C677T位點各基因型間，血漿HCY水平亦無顯著差異。健康老年人群、青年人群TT基因型血漿HCY水平差異顯著(P<0.05)。結論長治人群MTHFR C677T純合突變基因型頻率高，且老年人群TT基因型血漿HCY水平顯著高于青年人群。

關鍵詞〔〕同型半胱氨酸；N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶

中圖分類號〔〕R394〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：山西省回國留學人員科研資助項目(2014-072)

第一作者：陳云霞(1972-)，女，碩士，副教授，主要從事基因多態性與疾病易感性研究。

同型半胱氨酸(HCY)水平的升高增加了心腦血管疾病的風險〔1〕。N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是HCY代謝過程中的關鍵酶，MTHFR C677T突變可降低酶的活性，引起血漿HCY濃度增加〔2〕。本文分析老年人群血漿HCY水平、MTHFR C677T基因多態性及兩者間的相關性，旨在為MTHFR基因突變與HCY代謝相關疾病病因研究假設提供遺傳學數據。

1材料與方法

1.1研究對象2009～2012年在長治醫學院附屬和平醫院體檢的長治地區健康人群中隨機選擇147例，其中老年組(年齡60～73歲)78例，青年組(年齡22～35歲)69例作為對照組。

1.2試劑與儀器Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶TaqⅠ、DL2000 DNA Marker、PCR引物合成、血液基因組DNA提取試劑盒、PCR產物凝膠回收試劑盒(大連寶生物工程公司)；人HCY酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(上海微晶生物試劑有限公司)；MJ RESEARCH PTC-100基因擴增儀(美國Mj RESEARCH公司)；AlphaEase FC凝膠成像系統(美國Alpha Innotech公司)；DG5032酶聯免疫檢測標儀(南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司)。

1.3血漿HCY水平測定研究對象均于清晨空腹抽取外周血2 ml注入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，1 000 r/min離心30 min去除顆粒后于-70℃保存備用。使用人HCY ELISA 檢測試劑盒測定血漿HCY水平，所有操作均按試劑盒要求進行。

1.4基因組DNA提取采集外周血1 ml注入EDTA抗凝管中，用血液基因組DNA提取試劑盒提取。核酸樣品經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后-20℃保存備用。

1.5MTHFR基因多態性檢測采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)法〔3〕擴增含MTHFR C677T基因片段，擴增引物為：5′-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GC-3′(上游)，5′-CCC ATG TCG GTG CAT GCC TT-3′(下游)；PCR反應體系為50 μl，其中10×PCR緩沖液(含Mg2+)5 μl，dNTP(各2.5 mmol/L)4 μl，DNA模板2 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各4 μl，最后用雙蒸水補足體系；PCR反應條件：94℃預變性5 min；擴增循環包括94℃變性1 min，53℃退火1.5 min，72℃延伸2 min，30個循環；循環結束72℃延伸10 min；擴增片段134 bp，凝膠回收后，經限制性內切酶TaqⅠ65℃過夜消化，酶切反應體系為20 μl，其中10×緩沖液2 μl，凝膠回收產物15.5 μl，BSA 2 μl，TaqⅠ0.5 μl；酶切產物用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析結果。

1.6統計學分析使用SPSS13.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK檢驗、Games-Howell檢驗及χ2檢驗。對基因型頻率在人群中的分布進行Hardy-Weinberg平衡(H-W平衡) 吻合度檢驗。

2結果

2.1血漿HCY水平長治地區健康老年人群血漿HCY水平為(11.0±3.1)μmol/L，健康青年人群血漿HCY水平為(8.2±3.2)μmol/L，兩者無顯著差異(t=1.890，P=0.095)。

2.2H-W平衡吻合度檢驗及MTHFR C677T基因多態性MTHFR C677T基因型頻率在健康老年人群(χ2=0.011，P=0.915)、健康青年人群(χ2=0.386，P=0.534)中均符合H-W平衡。健康老年人群、青年人群MTHFR C677T基因型頻率，差異無統計學意義(χ2=1.002，P=0.606)；健康老年人群、青年人群C、T等位基因頻率，差異無顯著性(χ2=0.732，P=0.392)。見表1。

2.3血漿HCY水平與MTHFR C677T多態性健康老年人群MTHFR C677T位點CC、CT、TT基因型血漿HCY水平經方差齊性檢驗，雙尾顯著性概率為0.656，方差齊性；單因素方差分析顯示三種基因型間HCY水平無顯著差異(P=0.340)，采用SNK法進行均值多重比較，CC與CT、CT與TT、CC與TT基因型間的HCY水平均無顯著差異(P>0.05)。健康青年人群MTHFR C677T位點CC、CT、TT基因型血漿HCY水平經方差齊性檢驗，雙尾顯著性概率為0.774，方差齊性；單因素方差分析顯示三種基因型間HCY水平無顯著差異(P=0.458，P>0.05)，采用SNK法進行均值多重比較，CC與CT、CT與TT、CC與TT基因型間的HCY水平均無顯著差異(P>0.05)。健康老年人群、青年人群CC基因型血漿HCY水平無顯著差異(t=0.953，P=0.368)；健康老年人群、青年人群CT基因型血漿HCY水平無顯著差異(t=1.964，P=0.085)；健康老年人群、青年人群TT基因型血漿HCY水平差異顯著(t=2.504，P=0.037)。見表2。

表1MTHFR C677T位基因型頻率及等位基因頻率

組別n 基因型頻率〔n(%)〕 等位基因頻率(%) CCCTTTχ2值P值CTχ2值P值老年組7812(15.38)38(48.72)28(35.90)青年組6914(20.29)37(53.62)18(26.09)1.0020.60639.7460.2647.1052.900.7320.392

組別nCCCTTT老年組789.8±2.210.9±2.711.6±2.4青年組698.0±2.98.2±3.18.3±3.11)

與老年組比較：1)P<0.05

3討論

有學者提出HCY的輕度升高本身就是致病的，或可作為相關疾病進展的生物標志〔4〕。我國人群尤其是正常人群HCY水平的研究尚不多，臨床多采用國外標準〔5〕。研究結果顯示，在長治地區健康育齡女性人群中，MTHFR C677T純合突變基因型頻率和突變等位基因頻率均高于國內外報道值〔6〕。本試驗對MTHFR基因型鑒定結果仍然顯示，在長治地區健康老年人群、青年人群中，MTHFR C677T純合突變基因型頻率和突變等位基因頻率均高，而接近于文獻報道病例組水平〔7,8〕。本試驗MTHFR C677T基因型頻率在老年人群、青年人群中均符合H-W平衡。該組數據可為MTHFR基因突變與同型半胱氨酸代謝相關疾病病因研究假設提供遺傳學數據。研究表明，大部分高HCY血癥可以通過補充葉酸、維生素B6、維生素B12減輕或糾正，MTHFR C677T的純合突變子(TT)對飲食補充葉酸的反應尤為良好〔9〕。鑒于長治地區人群MTHFR C677T純合突變基因型頻率高，且老年人群TT基因型血漿HCY水平顯著高于青年人群的特點，建議長治地區人群尤其老年人群應在飲食中適量補充葉酸、維生素B6、維生素B12。

4參考文獻

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9Sharp L,Little J.Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and colorectal neoplasia:a huge review〔J〕.Am J Epidemiol,2004；159(5):423-43.

〔2014-05-06修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)