TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯合衣霉素促進人乳腺癌細胞凋亡

TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯合衣霉素促進人乳腺癌細胞凋亡

林哲洙張紅張磊羅文棟

(遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院腫瘤外科，遼寧錦州121000)

摘要〔〕目的觀察TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯合衣霉素促進人乳腺癌細胞凋亡作用。方法取對數生長期的人乳腺癌細胞株MCF-7接種，隨機分為對照組、衣霉素組、TR4單抗組及TR4單抗-衣霉素聯合組。采用MTT比色法測定24、48、72、96 h各組細胞增殖情況。利用流式細胞儀測定細胞凋亡情況。結果TR4單抗組、衣霉素組及TR4單抗-衣霉素聯合組MCF-7細胞增殖曲線較對照組呈現出明顯的降低趨勢，其中24 h時最為明顯。對照組、TR4單抗組、衣霉素組及TR4單抗-衣霉素聯合組細胞凋亡率為0.44%、10.12%、14.85%、36.51%，，各組間細胞凋亡率差異顯著(P<0.05)。結論TRAIL-R4通過結合癌細胞表面的死亡受體來誘導或促進腫瘤細胞的凋亡；聯合衣霉素能更好地促進TRAIL-R4對乳腺癌細胞的凋亡誘導作用，具體的相關信號轉導機制需要深入的研究來證實。

關鍵詞〔〕TRAIL-R4；衣霉素；乳腺癌細胞；凋亡

中圖分類號〔〕R737.11〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：遼寧醫(yī)學院博士啟動項目(No.Y2011B09)

第一作者：林哲洙(1973-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤學及普通外科學研究。

目前尚無較為有效且安全性好的乳腺癌治療方法，手術、化放療、內分泌治療等手段均存在一定的局限性。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是與細胞死亡密切相關的腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一，能與死亡受體(DR)4等相結合，誘導腫瘤細胞發(fā)生特異性凋亡，因而成為應用前景廣泛的抗腫瘤制劑〔1～3〕。近幾年，針對抗-DR4的單克隆激動劑抗體的研究報道較多，此類抗體的作用或效果比TRAIL更為明顯〔4，5〕，且穩(wěn)定性也較TRAIL重組體更為顯著。但TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯合衣霉素在人乳腺癌細胞凋亡中的研究尚未有報道。本研究利用TRAIL-R4特異性單克隆抗體聯合衣霉素，觀察對人乳腺癌細胞系MCF7中腫瘤細胞的增殖及凋亡的影響。

1材料與方法

1.1主要材料 DMEM細胞培養(yǎng)液購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，胎牛血清購自上海勁馬生物科技有限公司，重組人TRAIL(可溶性)為近岸蛋白質科技有限公司產品，衣霉素購自上海研拓生物科技有限公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自Roche羅氏。人乳腺癌細胞株MCF-7購自美國BD公司。

1.2細胞增殖檢測采用MTT比色法進行細胞測定，取對數生長期的人乳腺癌細胞株MCF-7接種于96孔板，37℃培養(yǎng)12 h后，隨機分為對照組、衣霉素組、TR4單抗組及TR4單抗-衣霉素聯合組。將細胞按4×104個/孔接種于96孔板，37℃培養(yǎng)，24 h過夜。其中對照組加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)；TR4單抗組加入TR4單抗，濃度為1.5 mg/L；衣霉素組采用DMSO培養(yǎng)基稀釋，濃度為1 mg/L；TR4單抗組直接加入TR4單抗，濃度為1.5 mg/L；TR4單抗-衣霉素聯合組先用衣霉素處理12 h后，再加入TR4單抗處理，均37℃培養(yǎng)48 h。測定24、48、72、96 h各組細胞增殖情況。

1.3流式細胞術取對數生長期的人乳腺癌細胞株MCF-7細胞用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液稀釋至一定濃度，并接種于6孔培養(yǎng)板，每一孔約2 ml，細胞數每孔約4×105個，37℃下，5%CO2培養(yǎng)24 h，隨機分組為對照組、衣霉素組、TR4單抗組及TR4單抗-衣霉素聯合組。其中對照組加入等體積DMSO；衣霉素組采用DMSO培養(yǎng)基稀釋，濃度為1 mg/L；TR4單抗組加入TR4單抗，濃度為1.5 mg/L，37℃恒溫，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；TR4單抗-衣霉素聯合組先用衣霉素處理12 h后，再加入TR4單抗處理，均37℃培養(yǎng)48 h，收集細胞，以冷磷酸緩沖液(PBS)沖洗3遍。吸取100 μl細胞懸液(含1×105個細胞)至5 ml培養(yǎng)管中，加入5 μl Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑+5 μl PI液，輕柔搖勻，室溫下避光15 min，到溶液穩(wěn)定后加入緩沖液400 μl混合后利用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行t、χ2檢驗。

2結果

2.1 不同組別MTT檢測結果比較TR4單抗、衣霉素顯示明顯的抑制MCF-7細胞生長的作用，TR4單抗組、衣霉素組及聯合組MCF-7細胞增殖曲線較對照組呈現出明顯的降低趨勢，其中24 h時最為明顯。見圖1。

圖1　不同培養(yǎng)時間下各組別細胞增殖情況

2.2不同組別乳腺癌細胞凋亡情況TR4單抗、衣霉素單獨應用能引起部分人乳腺癌細胞的凋亡，聯合應用凋亡作用增強明顯，對照組、衣霉素組、TR4單抗組和聯合組細胞凋亡率分別為0.44%、10.12%、14.85%、36.51%，各組差異顯著(P<0.05)，見圖2。

圖2　不同處理條件下細胞凋亡情況

3討論

乳腺癌發(fā)病率居高不下，呈現逐年上升趨勢，尤其是在我國經濟發(fā)達地區(qū)則更為明顯〔6，7〕。腫瘤是一種基因性疾病，是患者體內的多種原癌基因可能被激活所導致〔8，9〕。因此，探索有效且安全殺傷乳腺癌細胞的藥物是目前研究的熱點〔10～14〕。鑒于TRAIL可選擇性地誘導癌細胞凋亡，而對正常細胞較為安全，且針對TRAIL 敏感性的調控因子及機制的研究有助于腫瘤治療，已在腫瘤治療領域成為關注焦點〔15〕。TRAIL-Rs在多種細胞中均有表達，包括腫瘤及正常細胞〔16〕。其配體可激活TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)兩種功能性受體來誘導并加速或促進相應腫瘤細胞的凋亡，不過，腫瘤細胞針對藥物容易產生抗藥性，所以針對TRAIL被應用為抗腫瘤藥的開發(fā)尚未被廣泛利用〔17～19〕。

衣霉素是放線菌產生的一種核苷酸抗生素，具有一定的抑制病毒繁殖的作用。衣霉素對人肺腺癌A549細胞內質網應激(ERS)存在明顯的誘導作用，可加速人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)凋亡細胞的凋亡〔20〕，與其他試劑聯合有效上調TRAIL或TRAIL單克隆抗體的死亡受體的表達是一個有吸引力的想法，特別是在腫瘤顯示TRAIL的內在性耐藥的情況下。TR4誘導的細胞凋亡具有明顯的特征性，即對不同的癌細胞有不同的敏感性及抗性，研究〔21〕顯示，用經化療藥處理后的癌細胞進行試驗，其可以明顯逆轉癌細胞對TR4的抗性，聯合化療藥物對于癌細胞的凋亡誘導作用較為明顯。TR4的活性作用機制推測為：利用與其受體的結合來促使癌細胞的凋亡，TRAIL的受體基因一般是定位于8q21-22，TRAIL的凋亡信號傳導必須通過FAS相關死亡結構域(FADD)傳入胞質的下游。TR4通過活化半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶等系列分子來參與啟動凋亡的過程。衣霉素可通過上調TRAIL R1和TRAIL R2達到增強人結腸癌細胞和前列腺癌細胞對TRAIL誘導凋亡敏感性的目的〔22～24〕，Jung等〔25〕通過染色流式細胞儀檢測衣霉素與TRAIL作用于細胞前后的細胞凋亡率發(fā)現，衣霉素可明顯增加TRAIL誘導的胃腺癌細胞凋亡率。本研究結果可能是衣霉素通過上調細胞表面的TRAIL受體表達來增強乳腺癌細胞對TRAIL誘導的凋亡敏感性。可見，衣霉素自身不但具有一定的凋亡誘導作用，同時還可能通過啟動TRAIL的凋亡誘導程序，誘導并促使乳腺癌細胞TRAIL4的表達的增高，促進腫瘤細胞凋亡。但其具體的相關信號轉導機制需要深入研究證實。

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〔2014-09-06修回〕

(編輯苑云杰)