維持性血液透析患者血清分泌型Klotho蛋白與冠狀動脈粥樣硬化的關系

鄭淑蓓，金領微，周志宏（溫州醫科大學附屬第二醫院 腎內科，浙江 溫州 325027）

·臨 床 經 驗·

維持性血液透析患者血清分泌型Klotho蛋白與冠狀動脈粥樣硬化的關系

鄭淑蓓，金領微，周志宏
（溫州醫科大學附屬第二醫院 腎內科，浙江 溫州 325027）

目的：探討維持性血液透析（MHD）患者血清分泌型Klotho蛋白與冠狀動脈粥樣硬化的關系。方法：收集152例MHD患者臨床資料，ELISA法檢測血清分泌型Klotho蛋白濃度。根據冠脈造影檢查結果了解患者冠狀動脈粥樣硬化情況，分別記錄冠狀動脈病變累及支數及計算冠狀動脈病變Syntax積分。logistic回歸分析法分析MHD患者發生冠狀動脈粥樣硬化的危險因素，受試者工作特征曲線（ROC）評價血清分泌型Klotho蛋白診斷冠狀動脈粥樣硬化的準確性與特異性。結果：152例MHD患者中81例存在冠狀動脈粥樣硬化。血清分泌型Klotho蛋白濃度四分位數小于P25的I組患者冠狀動脈粥樣硬化比率最高，Klotho蛋白水平與冠狀動脈粥樣硬化呈負相關（r=-0.260，P=0.001）。血清分泌型Klotho蛋白濃度與冠狀動脈病變支數呈負相關（r= -0.268，P=0.001）；與冠狀動脈病變Syntax積分呈負相關（r=-0.223，P=0.046）。logistic回歸分析顯示，血清分泌型Klotho濃度降低（OR=3.125，95%CI 1.298～7.522）是冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素（P=0.011）；ROC分析顯示Klotho蛋白診斷冠狀動脈粥樣硬化的曲線下面積（AUC）為0.650（截點為373.825 pg/mL，其敏感性為81.7%，特異性為44.4%）。結論：MHD患者血清分泌型Klotho蛋白水平與冠狀動脈粥樣硬化相關，與冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度負相關；Klotho蛋白濃度降低是患者發生冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素。血清分泌型Klotho蛋白濃度檢測有助于診斷MHD患者冠狀動脈粥樣硬化，并可判斷冠狀動脈病變的嚴重程度。

分泌型Klotho蛋白；血液透析；冠狀動脈；動脈粥樣硬化

維持性血液透析（maintenance hemodialysis，MHD）患者是心血管疾病的高危人群，其并發的心血管疾病中，動脈粥樣硬化備受關注。動脈粥樣硬化是多種病因造成的動脈壁內膜的一系列復雜分子和細胞改變，始發于內皮細胞損傷[1]。而透析患者體內存在的異常氧化應激反應，在血管內皮損傷過程中發揮著較為主導的作用。Klotho基因是一種抑制老化的基因[2]，其編碼的Klotho蛋白分為膜型和分泌型，后者表達量明顯高于前者。目前認為分泌型Klotho蛋白作為一種激素參與對機體功能的調節，它能促進內皮源性一氧化氮合成，保護內皮細胞，減輕動脈粥樣硬化程度[3]。近年有作者報道Klotho蛋白表達與冠心病發病呈負相關，可能具有保護效應[4]。但MHD患者血清分泌型Klotho蛋白濃度變化與冠狀動脈粥樣硬化的關系鮮見報道。我們通過觀察兩者關系，探討分泌型Klotho蛋白在MHD患者冠狀動脈粥樣硬化發病中的作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選取2011年9月至2014年3月間在溫州醫科大學附屬第二醫院行MHD治療≥3個月，并在此期間行冠狀動脈造影檢查的患者152例。排除標準：急性腎功能不全，或考慮有急性腎損傷因素；伴有自身免疫性疾病、使用激素或免疫抑制劑；近1個月內有感染或使用過抗生素；近1個月內有過手術或外傷史；嚴重營養不良或伴有惡性腫瘤；伴有精神疾病或行動不便無法配合檢查者。本研究經本院倫理委員會批準。

所有患者均采用碳酸氫鹽透析液，POLYFLUX 14L透析器。血流量250～350 mL/min，透析液流量500 mL/min，每周透析3次，每次4 h，每次透析超濾均達到臨床估算的干體質量。

1.2 研究方法

1.2.1 記錄一般情況：記錄患者病史，包括原發疾病、伴隨疾病（糖尿病、高血壓）、吸煙、飲酒等情況；記錄分泌型Klotho蛋白檢測當日患者透析前血壓、身高和體質量，計算體質量指數（body mass index，BMI）。

1.2.2 血生化檢查：所有患者于檢測分泌型Klotho蛋白當日測透前空腹血糖（FBG）、血紅蛋白（HB）、鈣（Ca2+）、磷（P3+）、甲狀旁腺激素（PTH）、總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、白蛋白（ALB）、C反應蛋白（CRP）等，計算患者尿素清除指數（Kt/V）。

1.2.3 血清分泌型Klotho蛋白檢測：酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測患者透前血清分泌型Klotho蛋白濃度。ELISA試劑盒購自上海博耀生物科技有限公司，按產品說明書操作。

1.3 分泌型Klotho蛋白與冠狀動脈粥樣硬化的關系 根據患者分泌型Klotho蛋白水平分布范圍的四分位數分為4組：I組：Klotho＜P25；II組：P25≤Klotho＜P50；III組：P50≤Klotho＜P75；IV組：Klotho ≥P75。根據冠狀動脈造影檢查結果比較各組間冠狀動脈粥樣硬化患者所占的比率。

根據冠狀動脈粥樣硬化病變直徑狹窄≥50%的標準，分為0支病變、1支病變、2支病變及多支病變，比較各組間冠脈各支病變患者所占的比率。

運用SYNTAX官方網站所下載的SYNTAX評分計算器（2.02版本），對冠狀動脈病變直徑狹窄≥50%的患者的冠狀動脈病變情況進行評分[5]。根據Syntax積分結果，分為低危組（1～22分）、中危組（23～32分）及高危組（≥33分），比較各組患者間血清分泌型Klotho蛋白的變化。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS19.0統計軟件進行數據的分析處理。正態分布的計量資料用±s表示，組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。非正態分布的計量資料用M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料用例數和百分率描述，組間比較采用x2檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni法調整檢驗水準進行。采用logistic回歸分析MHD患者發生冠狀動脈粥樣硬化的危險因素，受試者工作特征曲線（ROC）評價血清分泌型Klotho蛋白診斷冠狀動脈粥樣硬化的準確性與特異性。P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料及生化檢查 152例MHD患者按照血清分泌型Klotho蛋白水平分布范圍分組，I組Klotho ＜352.12 pg/mL；II組Klotho 352.12～400.18 pg/ mL；I I I組Klotho 400.18～450.94 pg/mL；IV組Klotho ≥450.94 pg/mL。所有患者臨床資料及生化檢查結果見表1。

結果顯示，4組患者HB組間差異有統計學意義（P =0.045），組間兩兩比較顯示I組患者HB較II組明顯降低，差異有統計學意義（P=0.005），回顧2組患者的用藥方案，發現II組患者在入選前使用促紅素及鐵劑比率明顯高于I組。4組患者FGB組間差異有統計學意義（P=0.040），組間兩兩比較顯示III組和IV組患者FGB較I組低，差異有統計學意義（P分別為0.015、0.016），考慮與I組患者糖尿病比率較高相關。4組間余血生化指標、心血管相關危險因素等差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 152例MHD患者臨床表現及血生化檢查結果（n=38）

2.2 各組間冠狀動脈粥樣硬化情況 152例患者中存在冠狀動脈粥樣硬化的有81例，比較不同分泌型Klotho蛋白水平組間冠狀動脈粥樣硬化比率，差異有統計學意義（P=0.040）。以I組為對照組，Bonferroni法調整檢驗水準（α’=0.05/（4-1）=0.017）后發現，I組患者冠狀動脈粥樣硬化比率顯著高于IV組，差異有統計學意義（P=0.006）；I組與II、III組患者間冠狀動脈粥樣硬化比率差異無統計學意義（P分別為0.154、0.036），考慮與該2組間Klotho蛋白濃度差異相對較小相關，見表1。Spearman相關性分析顯示，Klotho蛋白水平與冠狀動脈粥樣硬化呈負相關（r=-0.260，P=0.001）。

2.3 血清分泌型Klotho蛋白與冠狀動脈粥樣硬化程度的關系 按冠脈病變累及支數分組，發現冠脈多支病變所占比率高的MHD患者血清分泌型Klotho蛋白水平較低，組間差異有統計學意義（P=0.009）。I組患者Klotho蛋白水平最低，其冠狀動脈粥樣硬化累及支數顯著高于其他3組，差異有統計學意義（與II組比較，P=0.030；與III組比較，P=0.007；與IV組比較，P=0.021）。見圖1。Spearman相關性分析顯示，血清Klotho水平與冠狀動脈病變支數呈負相關（r=-0.268，P=0.001）。

圖1 不同冠脈病變支數患者在各組間所占比率

對冠脈病變直徑狹窄≥50%的81例患者，按冠狀動脈病變Syntax積分分組，各組間分泌型Klotho蛋白差異有統計學意義（P=0.039）。組間兩兩比較顯示高危組患者Klotho蛋白水平較低，與低危組相比差異有統計學意義（P=0.015）；高危組與中危組患者Klotho蛋白水平比較差異無統計學意義（P= 0.097），見表2。Spearman相關性分析顯示，血清Klotho水平與Syntax積分呈負相關（r=-0.223，P= 0.046）。

表2 冠脈病變Syntax積分亞組血清分泌型Klotho蛋白比較

2.4 影響MHD患者冠狀動脈粥樣硬化的危險因素分析 以血清分泌型Klotho蛋白的中位數400.52 pg/ mL作為分界值，＜400.52 pg/mL視為低Klotho濃度。以是否存在冠狀動脈粥樣硬化作為因變量，logistic回歸分析顯示，血清Klotho濃度降低（OR=3.125，95%CI 1.298～7.522）、年齡增長（OR=1.075，95%CI 1.027～1.126）和糖尿病（OR=3.615，95%CI 1.075～12.155）是MHD患者冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素（P分別為0.011，0.002和0.038）。

2.5 ROC曲線評價血清分泌型Klotho蛋白診斷MHD患者冠狀動脈粥樣硬化的準確性與特異性 血清分泌型Klotho蛋白診斷MHD患者冠狀動脈粥樣硬化的曲線下面積（AUC）為0.650（95%CI 0.563～0.737，P=0.001），提示Klotho蛋白診斷冠狀動脈粥樣硬化的準確性較高。取Klotho濃度為373.825 pg/mL作為截點時，其診斷冠狀動脈粥樣硬化的敏感性和特異性分別為81.7%和44.4%。

3 討論

Klotho蛋白是一種肽類激素，其基因于1997年由日本學者Kuro-o等[2]在研究高血壓病遺傳變化時首先發現。該基因缺陷小鼠的表型同人類衰老的表現極為相似：生長遲滯、壽命縮短、活動減少、步態紊亂、肺氣腫、 生殖器官和胸腺萎縮、動脈硬化、異位鈣化、骨質疏松、皮膚萎縮、生殖細胞分化障礙、腺垂體功能異常、血中鈣磷異常、糖代謝異常等等，因此Klotho基因被稱為抗衰老基因。Klotho基因通過不同的hnRNA選擇性剪切形成的表達產物有分泌型和膜型兩種蛋白異構體，分泌型Klotho蛋白為表達優勢型。目前認為分泌型Klotho蛋白作為一種激素參與對機體功能的調節，它可以通過調節某些離子通道活性，抑制胰島素/胰島素樣生長因子1信號轉導通路，增強機體抗氧化應激能力，并能促進內皮源性一氧化氮合成，對多種靶器官發揮類似抗衰老激素作用，與衰老和衰老相關性疾病有著密切的聯系[3]。

透析患者由于慢性腎功能衰竭，腎臟多種基因的表達和功能都受到嚴重影響，表現出的各種并發癥尤其是心血管病變與Klotho基因缺陷小鼠十分相似。Koh等[6]觀察了10例臨床或組織學診斷為慢性腎功能衰竭的患者腎組織中Klotho的變化，用酶保護分析法檢測了患者腎臟Klotho基因的表達情況，用蛋白質印跡分析和免疫組織化學法檢測了腎組織中Klotho蛋白的表達情況，結果顯示全部患者腎臟Klotho mRNA明顯降低，Klotho蛋白表達也顯著降低。表明慢性腎功能衰竭患者腎臟Klotho基因表達的下降可能是其系列并發癥進行性發生的基礎。

劉威等[4]對80例冠心病患者與100例對照者進行危險因素調查，發現冠心病患者血清Klotho蛋白濃度低于對照組，血清Klotho蛋白對于預防冠心病有保護效應。更引人關注的是，Klotho基因只在腎臟、腦的脈絡膜、生殖器官等有限的組織器官中表達，特別是在腎小管上皮細胞中呈強表達[3，7]，提示Klotho的功能可能與腎臟病患者系列并發癥的發生有關。蔡宏等[8]探討了MHD患者血管鈣化與可溶性Klotho蛋白之間的關系，發現血清Klotho蛋白濃度降低是MHD患者腹主動脈重度鈣化的獨立危險因素。

本研究結果顯示152例MHD患者中81例存在冠狀動脈粥樣硬化，占53%，提示冠狀動脈粥樣硬化在MHD患者中有較高的發病率。同時我們發現患者血清分泌型Klotho蛋白越低，冠狀動脈粥樣硬化比率越高。在Klotho蛋白水平最低組，其冠脈病變累及多支所占比率最高，冠狀動脈粥樣硬化病變程度最重。進一步對冠脈病變程度進行Syntax積分評估，結果顯示患者Syntax積分越高，Klotho蛋白水平越低。logistic回歸分析顯示血清分泌型Klotho蛋白濃度降低是MHD患者冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素。其機制可能為分泌型Klotho蛋白水平降低導致血管內皮細胞功能失調，特別是一氧化氮合成下降[9]。而一氧化氮作為內源性血管舒張因子的主要成分，能抑制血管壁及循環血中的一些活性因子，抑制血管平滑肌細胞增生，防止內皮損傷及動脈粥樣硬化形成[10]。Klotho蛋白也可抑制P53/P21表達，緩解過氧化氫所誘導的內皮細胞衰老，因此Klotho蛋白減少可造成血管內皮細胞的衰老和凋亡，促進動脈粥樣硬化的發生[11]。

綜上所述，MHD患者血清分泌型Klotho蛋白水平與冠狀動脈粥樣硬化相關，與冠狀動脈粥樣硬化嚴重程度負相關；Klotho蛋白濃度降低是患者發生冠狀動脈粥樣硬化的獨立危險因素。血清分泌型Klotho蛋白濃度檢測有助于診斷MHD患者冠狀動脈粥樣硬化，并能判斷其冠脈病變嚴重程度，具有一定的應用前景。以Klotho蛋白為靶點來對抗氧化應激反應、保護血管內皮功能，可能會成為防治透析患者并發動脈粥樣硬化的一條有效途徑。

[1] Brandes RP,Fleming I,Busse R.Endothelial aging[J].Cardiovasc Res,2005,66(2):286-294.

[2] Kuro-o M,Matsumura Y,Aizawa H,et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing [J].Nature,1997,390(6655):45-51.

[3] Li SA,Watanabe M,Yamada H,et al.Immunohistochemical localization of Klotho protein in brain,kidney,and reproductive organs of mice[J].Cell Struct Funct,2004,29(4):91-99.

[4] 劉威,康林,曹貴方.血清KLOTHO濃度與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的關系[J].嶺南心血管病雜志,2012,18(5):463-464,534.

[5] Sianos G,Morel MA,Kappetein AP,et al.The SYNTAX Score:an angiographic tool grading the complexity of coronary artery disease[J].Eurointervention,2005,1(2):219-227.

[6] Koh N,Fujimori T,Nishiguchi S,et al.Severely reduced production of klotho in human chronic renal failure kidney [J].Biochem Biophys Res Commun,2001,280(4):1015 -1020.

[7] Negri AL.The klotho gene:a gene predominantly expressed in the kidney is a fundamental regulator of aging and calcium/phosphorus metabolism[J].J Nephrol,2005,18(6):654-658.

[8] 蔡宏,嚴玉澄,陸任華,等.血清可溶性Klotho水平與維持性血液透析患者腹主動脈鈣化相關[J].中華腎臟病雜志,2013,29(2):103-107.

[9] Saito Y,Yamagishi T,Nakamura T,et al.Klotho protein protects against endothelial dysfunction[J].Biochem Biophys Res Commun,1998,248(2):324-329.

[10] Langberg JJ,Gallagher M,Strickberger SA,et al.Temperature-guided radiofrequency catheter ablation with very large distal electrodes[J].Circulation,1993,88(1):245-249.

[11] Ikushima M,Rakugi H,Ishikawa K,et al.Anti-apoptotic and anti-senescence effects of Klotho on vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,339(3):827-832.

（本文編輯：丁敏嬌）

Serum secretory Klotho is associated with coronary atherosclerosis in patients on maintenance hemodialy- sis

ZHENG Shubei,JIN Lingwei,ZHOU Zhihong.
Department of Renal Medicine,the Second Affiliated Hos-pital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To determine the relationship between serum secretory Klotho and coronary atherosclerosis in maintenance hemodialysis (MHD) patients.Methods:One hundred and fifty-two cases of MHD patients,who were underwent coronary artery angiography,were collected prospectively.Serum secretory Klotho was detected by ELISA.Coronary artery lesions involving the count and Syntax score were recorded by the result of coronary angiography examination.Logistic regression analysis was used to determine the risk factor of coronary atherosclerosis in MHD patients.The ROC analysis was applied to evaluate the diagnostic value of secretory Klotho in coronary atherosclerosis.Results:Eigty-one patients had coronary atherosclerosis.Serum secretory Klotho concentration was negatively correlated with coronary atherosclerosis (r=-0.260,P=0.001).Secretory Klotho and counts of coronary artery lesion showed a negative correlation (r=-0.268,P=0.001).Secretory Klotho was also negatively correlated with Syntax score (r=-0.223,P=0.046).Logistic regression analysis showed that lower secretory Klotho level was an independent risk factor for coronary atherosclerosis (OR=3.125,95%CI 1.298～7.522).ROC-AUC of serum secretory Klotho for coronary atherosclerosis was 0.650 (cut off 373.825 pg/mL,accuracy 81.7%,specificity 44.4%).Conclusion:Serum secretory Klotho of MHD patients is associated with coronary atherosclerosis,and is negatively related to the severity of coronary atherosclerosis,also is an independent risk factor in MHD patients with coronary atherosclerosis.Serum secretory Klotho may have diagnostic value for coronary atherosclerosis in MHD patients,and can judge the severity of coronary artery lesions.

secretory Klotho; hemodialysis; coronary artery; atherosclerosis

R459.5；R541.4

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.012

2014-08-07

溫州市科技計劃項目（Y20140057）。

鄭淑蓓（1979-）女，浙江溫州人，主治醫師，碩士。