microRNA-101a與COX-2在尿酸性腎病模型中的變化

葉菡洋，金建，李占園，陳琰，鄭育，金領微，周志宏

（溫州醫科大學附屬第二醫院，浙江 溫州 325027，1.腎內科；2.內分泌科）

·論 著·

microRNA-101a與COX-2在尿酸性腎病模型中的變化

葉菡洋1，金建2，李占園1，陳琰1，鄭育1，金領微1，周志宏1

（溫州醫科大學附屬第二醫院，浙江 溫州 325027，1.腎內科；2.內分泌科）

目的：觀察microRNA-101a（miR-101a）和環氧化酶-2（COX-2）在尿酸性腎病大鼠模型中的變化情況。方法：將24只雄性SD大鼠隨機分成3組，即正常對照組（BC組）、模型組（M組）和塞來昔布組（S組），每組各8只，以含酵母和腺嘌呤的飼料喂養造模，21 d后檢測各組大鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）的含量，并用實時定量PCR技術檢測大鼠腎臟皮質中miR-101a的表達及Wersten Blot法檢測COX-2及caspase-3的表達。結果：M組Cr、BUN、UA較BC組升高（P＜0.05），S組Cr、BUN、UA較M組降低（P＜0.05）；M組miR-101a的表達較BC組明顯降低（P＜0.05），S組miR-101a的表達較M組大鼠升高（P＜0.05）；M組COX-2及caspase-3的表達較BC組明顯升高（P＜0.05），S組COX-2及caspase-3的表達較M組明顯降低（P＜0.05）。結論：miR-101a表達降低及COX-2表達升高可能參與高尿酸引起的腎臟損害的過程，COX-2特異性抑制劑塞來昔布可減輕其損害。

尿酸性腎病；microRNA-101a；環氧化酶-2；塞來昔布；凋亡；大鼠

高尿酸血癥在我國當代人口中越來越常見，并有年輕化趨勢，其導致的尿酸性腎病也是引起腎臟功能不全常見的原因之一。尿酸性腎病的主要機制是尿酸鹽結晶在腎小管和腎間質的沉積而引起的局部炎癥反應，炎癥細胞浸潤，導致腎小管上皮細胞凋亡壞死，上皮萎縮，間質纖維化。環氧化酶-2（cycloxygenase-2，COX-2）是公認的介導炎癥的重要蛋白之一，在多種炎癥的發生發展過程中起重要的促進作用[1]。近年來，研究報道microRNA-101a （miR-101a）具有調節COX-2表達的作用，參與許多炎癥反應的過程[2-3]。本實驗建立高尿酸血癥大鼠模型，觀察miR-101a和COX-2的表達水平，并研究COX-2特異性抑制劑塞來昔布是否具有減輕高尿酸引起的腎臟損害的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 24只雄性SD大鼠（體質量200～250 g，實驗動物合格證號20120002）購自上海萊克實驗動物有限責任公司；酵母干粉，UNIPATH公司產品；腺嘌呤，MERCK公司產品；塞來昔布由輝瑞制藥有限公司提供；血生化分析儀Roche cobasc 501購自德國羅氏診斷有限公司；RT試劑盒購自加拿大MBI Fermentas公司；miScript Reverse Transcription Kit購自Qiagen公司；DEPC水（RNase-free and DNasefree）均購自Invitrogen公司；PCR試劑盒（SYBR Green Real time PCR Master Mix），96孔板及封板膜均購自ABI公司；電泳轉印系統購自BIO-RAD公司；COX-2和caspase-3引物均購自Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Pierce公司；COX-2抗體、caspase-3抗體及山羊抗兔抗體購自Abcam公司；Backman DU800計算機分光光度分析儀Backman；酶標儀ECX800購自Bio-TEX；其他試劑均為進口或國產分析純。

1.2 大鼠飼養、分組及模型制作 24只雄性SD大鼠，均清潔級飼養環境穩定飼養，分3組，各8只：①正常對照組（BC組）：給予常規的飼料（市售飼料）飼養；②模型組（M組）：給予含酵母粉和腺嘌呤飼料（85 g市售飼料+15 g酵母+100 mg腺嘌呤）飼養[4]；③塞來昔布組（S組）：給予含酵母粉和腺嘌呤飼料（85 g市售飼料+15 g酵母+100 mg腺嘌呤）飼養，并予塞來昔布懸液25 mg/kg每日灌胃。21 d后靜脈取血并取左側腎臟皮質組織檢測相關指標。

1.3 血清肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）的檢測 造模21 d后，抽取大鼠靜脈血，用常規生化測定方法檢測腎功能指標Cr、BUN、UA的水平。

1.4 Real time PCR技術檢測各組中miR-101a的表達量 取腎臟皮質組織50～100 mg，加Trizol裂解，氯仿萃取，異丙醇濃縮過夜，提取總RNA，再取100 ng總RNA，應用miRNA Isolation Kit分離小于100 nt的小分子RNA，應用miScript Reverse Transcription Kit反轉錄合成cDNA，反轉錄引物：5’-GTC GTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTT CGTT-3’。在ABI 7500 FAST進行定量PCR檢測。PCR條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環。上游引物：5’-TTCGTCGTCGTCGGTACAGTACTGTGAT-3’，下游引物：5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。以U6 RNA為內參，目的基因的相對表達率（relativeexpression，RQ）采用△△CT方法計算，miR-101a的△CT sample= CT sample-CT/U6 sample，△CT control=CT control-CT U6 control，△△CT=△CT sample-△CT control。

1.5 Western Blot檢測各組中COX-2及caspase-3蛋白表達水平 取腎臟皮質組織約30 mg，加蛋白裂解液研磨，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取蛋白50 μ g，行10% SDS-PAGE電泳并轉膜，用5%脫脂牛奶室溫下封閉1.5 h。一抗（COX-2 antibody 1∶800，caspase-3 antibody 1∶1 000）4 ℃孵育過夜，TBS-T溶液洗膜3次。室溫下加入IgG抗體（1∶4 000）孵育1.5 h，洗膜3次，用Odyssey近紅外雙色激光成像系統選擇800通道進行掃描條帶，以βactin作為內參照標化COX-2及caspase-3的表達，各組生物學重復3次，技術重復3次，用AlphaEaseFC凝膠成像分析軟件進行半定量分析。

1.6 統計學處理方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理。計量資料以±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，獨立的兩組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清Cr、BUN、UA的比較 SD大鼠飼養21 d后M組大鼠血Cr、BUN、UA均高于BC組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明尿酸性腎病大鼠模型造模成功。S組大鼠血Cr、BUN、UA低于M組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組腎功能指標的比較（n=8，±s）

與BC組比：aP＜0.05；與M組比：bP＜0.05

2.2 Real time PCR技術檢測各組中miR-101a的表達量 miR-101a的表達水平在M組（為0.48±0.17）較BC組（為1.00±0.00）明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而S組（0.71±0.21）較M組（0.48±0.17）明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3 Western Blot法檢測各組中COX-2及caspase-3蛋白表達水平 COX-2和caspase-3的表達水平在M組較BC組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而S組較M組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

3 討論

圖1 Real time PCR技術檢測miR-101a的表達

圖2 Western Blot法檢測各組中COX-2及caspase-3蛋白表達水平

尿酸性腎病對腎臟的損害以腎小管-間質病理改變為主要表現，光鏡下可見腎小管呈囊性擴張，上皮萎縮，間質細胞萎縮，間質纖維化，伴大量淋巴和單核細胞的浸潤[4]。研究報道，用含0.25%的腺嘌呤飼料飼養的雄性Wistar大鼠出現血尿酸升高，腎功能下降，腎臟組織炎癥遞質腫瘤壞死因子α（TNF-α）、核轉錄因子kappa B（NF-κB）等表達增多，伴有腎小管凋亡增多，腎間質膠原纖維含量增多[5]。Lobo等[6]研究50例血透患者發現伴有高尿酸血癥的患者血清中TNF-α、白細胞介素-6（IL-6）、C反應蛋白（CRP）、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）等炎癥因子處于高水平，推測尿酸在炎癥的發生過程中起重要作用。可見尿酸性腎病腎臟組織存在炎癥反應，這也是導致慢性腎臟損害的機制之一。本實驗用酵母粉聯合腺嘌呤誘導大鼠尿酸性腎病模型，21 d后測腎功能指標明顯升高，可見模型誘導成功。

COX-2是環氧化酶家族成員之一，介導前列腺素類炎癥遞質的產生，在炎癥過程中起重要的作用。在正常生理條件下，細胞COX-2處于低表達水平[7]，當受到炎癥刺激時，COX-2被誘導處于高表達水平。在缺血再灌注腎臟損傷中，COX-2大量被誘導生產，促進局部炎癥反應，而神經生長因子-1能通過抑制COX-2的表達，減少炎癥因子的產生，減少細胞凋亡[8]。有學者通過體外培養腎臟系膜細胞發現一定高濃度的尿酸能直接誘導COX-2和PGE2（前列腺素E2）的合成，促進炎癥反應[9]。caspase-3是細胞凋亡執行蛋白，反映細胞的整體凋亡水平。本實驗在高尿酸腎病大鼠模型中發現COX-2和caspase-3表達水平明顯升高，推測COX-2在高尿酸引起的腎臟炎癥反應中起重要作用，并促進細胞凋亡。用COX-2特異性抑制劑治療后，COX-2和caspase-3表達減少，細胞凋亡水平降低，進一步說明COX-2在高尿酸引起的炎癥介導的細胞凋亡中起重要作用。此外，本實驗中S組caspase-3表達水平較BC組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），表明S組細胞凋亡水平較BC組高。現研究已證實COX-2存在結構型和誘導型兩種形式，COX-2抑制劑能阻斷誘導型COX-2，減輕炎癥反應保護腎臟組織，也能阻斷結構型COX-2對腎臟產生毒害作用[10]。

本研究還發現在高尿酸腎病大鼠模型中miR-101a表達降低，并且與COX-2的表達水平呈相反趨勢。有研究[11]報道，miR-101a與COX-2基因的3’UTR區序列互補配對并與之結合從而抑制該基因的表達。此外，在一些腫瘤組織中發現miR-101a表達降低而COX-2升高，推測miR-101a對COX-2具有調節作用，這可能參與了腫瘤發生的機制[3，12]。Tanaka等[13]通過實驗證實帶有熒光標記的COX-2 3’URT區域的報告結構基團，起熒光活性能被miR-101a顯著抑制，說明miR-101a能直接與COX-2的3’URT直接結合，強烈推測COX-2是miR-101a的靶基因之一。成熟的miR-101a能直接調控COX-2的表達，在本實驗中，我們推測miR-101a在高尿酸性腎病中表達異常降低可能與COX-2表達增多有關。

綜上所述，我們推測miR-101a/COX-2在高尿酸引起的腎臟損害中起重要作用，具體機制尚有待進一步研究。

參考文獻：

[1] Weinberg JB.Nitric oxide synthase 2 and cyclooxygenase 2 interactions in inflammation[J].Immunol Res,2000,22(2-3):319-341.

[2] Harper KA,Tyson-Capper AJ.Complexity of COX-2 gene regulation[J].Biochem Soc Trans,2008,36(Pt 3):543-545.

[3] Strillacci A,Griffoni C,Sansone P,et al.MiR-101 downregulation is involved in cyclooxygenase-2 overexpression in human colon cancer cells[J].Exp Cell Res,2009,315(8):1439-1447.

[4] 何立群,聶永紅,鄒士林,新型尿酸性腎病動物模型的建立[J].上海實驗動物科學,2001,21(1):22-24.

[5] Diwan V,Mistry A,Gobe G,et al.Adenine-induced chronic kidney and cardiovascular damage in rats[J].J Pharmacol Toxicol Methods,2013,68(2):197-207.

[6] Lobo JC,Stockler-Pinto MB,da Nóbrega AC,et al.Is there association between uric acid and inflammation in hemodialysis patients?[J].Ren Fail,2013,35(3):361-366.

[7] Mitchell JA,Warner TD.Cyclo-oxygenase-2:pharmacology,physiology,biochemistry and relevance to NSAID therapy [J].Br J Pharmacol,1999,128(6):1121-1132.

[8] Ranganathan PV,Jayakumar C,Mohamed R,et al.Netrin-1 regulates the inflammatory response of neutrophils and macrophages,and suppresses ischemic acute kidney injury by inhibiting COX-2-mediated PGE2 production[J].Kidney Int,2013,83(6):1087-1098.

[9] Nicholas K,Melissa C,Eliana GV,et al.Identification of the molecular pathways that drive constitutive renal COX-2 expression:implications for novel COX-2-targetted therapies that spare the cardiovascular system[J].The FASEB Journal,2014,28(1):837-839.

[10] Convento MS,Pessoa E,Dalboni MA,et al.Pro-inflammatory and oxidative effects of noncrystalline uric acid in human mesangial cells:contribution to hyperuricemic glomerular damage[J].Urol Res,2011,39(1):21-27.

[11] Chakrabarty A,Tranguch S,Daikoku T,et al.MicroRNA regulation of cyclooxygenase-2 during embryo implantation [J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(38):15144-15149.

[12] Wang HJ,Ruan HJ,He XJ,et al.MicroRNA-101 is downregulated in gastric cancer and involved in cell migration and invasion [J].Eur J Cancer,2010,46(12):2295-2303.

[13] Tanaka T,Haneda S,Imakawa K,et al.A microRNA,miR-101a,controls mammary gland development by regulating cyclooxygenase-2 expression[J].Differentiation,2009,77 (2):181-187.

（本文編輯：胡苗苗）

The role of microRNA-101a and cycloxygenase-2 in kidney damage induced by hyperuricemia

YEHanyang1,JIN Jian2,LI Zhanyuan1,CHEN Yan1,ZHENG Yu1,JIN Lingwei1,ZHOU Zhihong1.
1.Department of Nephrology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027;2.Department of Endocrinology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325027

Objective:To investigate the effects of miR-101a and cycloxygenase-2 (COX-2) on rats model of urate nephropathy.Methods:Twenty four rats models of urate nephropathy through fed with yeast and adenine for 21 days were divided into three groups,normal control groups,model groups and celecoxib groups.Seum creatinine (Cr),blood urea nitrogen (BUN) and blood uric acid (UA) was tested after feeding with yeast and adenine for 21 days.The real time PCR was preformed to analyze the expression of miR-101a and Western Blot was preformed to analyze the expression of COX-2 and caspase-3 in renal cortex.Results:Cr,BUN and UA of model group were significantly higher than that of normal control groups (P＜0.05).The expression of miR-101a n renal cortex from model groups was lower than that of normal control groups (P＜0.05),while higher than that of celecoxib groups (P＜0.05).The expression of COX2 and caspase-3 in renal cortex from model groups were higher than that of normal control group (P＜0.05),while lower than that of celecoxib groups (P＜0.05).Concluion:Decreasing miR-101a and increasing COX2 may involve in kidney damage induced by hyperuricemia,celecoxib as a specific inhibitor protects kidney from this damage.

urate nephropathy; microRNA-101a; cycloxygenase-2; celecoxib; apoptosis; rats

R541

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.006

2014-06-06

葉菡洋（1979-），女，浙江溫州人，主治醫師，碩士。

周志宏，主任醫師，Email：markzhou@wzhealth.com。