垂盆草提取物對TGF-β 1誘導的腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化和基質累積的影響

楊嫆嫆，陸紅，吳蓮鳳，王斯璐，林成成，梁勇，白永恒（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 3505，．醫學檢驗中心；．外科實驗室）

·論 著·

垂盆草提取物對TGF-β 1誘導的腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化和基質累積的影響

楊嫆嫆1，陸紅1，吳蓮鳳1，王斯璐2，林成成2，梁勇2，白永恒2
（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325015，1．醫學檢驗中心；2．外科實驗室）

目的：探討垂盆草提取物（SSBE）對轉化生長因子（TGF-β1）誘導的腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化（EMT）和基質累積的影響。方法：將體外培養的大鼠腎小管上皮細胞系（NRK-52E）細胞分為只加入溶劑的對照組，只加入TGF-β1（濃度為5μg/L）的誘導組，以及加入SSBE（濃度為10和100 mg/L）和TGF-β1（濃度為5μg/L）的干預組。細胞形態變化采用倒置相差顯微鏡觀察；細胞免疫熒光染色檢測I I I型膠原、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達；反轉錄聚合酶鏈反應檢測α-SMA、骨形成蛋白-7（BMP-7）、緊密連接蛋白（Tjp1）、I型膠原（Col1a1）、I I I型膠原（Col3a1）、基質金屬蛋白酶-2 （MMP-2）和抑制因子-2（TIMP-2）mRNA的表達。結果：TGF-β1作用后，NRK-52E細胞形態發生變化，形成了長梭狀的肌成纖維細胞（MFs）；其上皮標志物E-cadherin和Tjp1的表達水平顯著下降，而MFs標志物α-SMA表達顯著增加；基質成分Col1a1和Col3a1的表達也明顯增高。應用10和100 mg/L的SSBE干預后，抑制了TGF-β1誘導的細胞形態改變和α-SMA、Col1a1和Col3a1的高表達，并促進E-cadherin和Tjp1的表達。另外，SSBE也提高了BMP-7表達水平和MMP-2/TIMP-2比值。結論：SSBE可抑制TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞纖維化樣改變，而這一作用與其能有效阻止EMT進程和基質累積有關。

垂盆草提取物；轉化生長因子-β1；上皮-間葉轉分化；基質累積

腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞表型轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腎間質纖維化發生發展的關鍵環節[1]。在EMT過程中，小管細胞喪失了上皮細胞的標志，如鈣黏蛋白（E-cadherin）等，形成了陽性表達α-平滑肌肌動蛋白α-SMA）的肌成纖維細胞（myofibroblasts，MFs）[2]。MFs是一種基質產生細胞，可分泌大量基質成分I型膠原（Col1a1）和I I I型膠原（Col3a1）在腎組織間隙累積從而導致纖維化的發生。抑制EMT進程，對防治腎間質纖維化具有十分重要的意義。垂盆草是一種景天科多年生草本植物，我們的前期研究顯示，其提取物（Sedum sarmentosum Bunge extract，SSBE）可拮抗馬兜鈴酸所致的腎小管上皮細胞纖維化樣改變[3]。這種抗纖維化作用，我們推測可能與SSBE抑制TGF-β 1的高表達密切相關。因此，本研究中我們擬采用TGF-β 1誘導腎小管上皮細胞（NRK-52E）出現EMT轉變，來探討SSBE對EMT和基質累積的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 SSBE，安徽宣城百草植物工貿公司；DMEM細胞培養液，美國Hyclone公司；胎牛血清，杭州四季青生物公司；胰蛋白酶和TRIzol提取液，美國Gibco公司；人重組TGF-β 1蛋白，美國PeproTech公司；Col3a1一抗，北京Bioss公司；α-SMA一抗，美國Santa Cruz公司；E-cadherin一抗，美國Abcam公司；熒光素（FITC）標記山羊抗兔IgG，北京康位生物公司；RT-PCR試劑，美國Promega公司。MyCycler梯度PCR儀，美國Bio-Rod公司；7500定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；Varioskan Flash全波長多功能掃描儀，美國Thermo Scien-tific公司；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡，德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞：大鼠腎小管上皮細胞株（NRK-52E）購于中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2.2 實驗分組和細胞形態學觀察：細胞培養前，按適當濃度接種于六孔板中，待融合到70%～80%時，換成無血清DMEM培養液并開始正式實驗。①對照組：未加入SSBE或TGF-β 1；②誘導組：培養液中加入TGF-β 1（濃度為5μg/L）；③治療組：培養液中同時加入SSBE和TGF-β 1（濃度為5μg/L），SSBE的濃度分別為10和100 mg/L。上述處理后的細胞置37 ℃和5% CO2的培養箱中培養，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。

1.2.3 real-time RT-PCR檢測mRNA表達：采用Trizol試劑提取已處理細胞中的RNA，于260/280 nm測定吸光度值以確定樣本純度和濃度。根據試劑說明書將RNA反轉錄成cDNA。設計骨形成蛋白-7（BMP-7）、α-SMA、緊密連接蛋白（Tjp1）、基質金屬蛋白酶2 （MMP-2）、基質金屬蛋白酶組織抑制劑2（TIMP-2）、Col1a1和Col3a1 mRNA特異性引物，以β-actin作為內參對照（見表1），由上海捷瑞公司合成。取反轉錄產物1 μL進行PCR擴增，PCR擴增體系：5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、2 μL引物（上、下游各1μL，終濃度200 nmol/L）、2μL反應緩沖液、1μL cDNA。擴增程序為：95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 35 s，40個循環。采用溶解曲線評價PCR結果可靠性，采用2-△△Ct計算相對mRNA表達量。△△Ct= [Ct目的基因（待測樣品）-Ct內參（待測樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-Ct內參（校正樣品）]。

表1 擴增EMT和基質成分mRNA特異性引物

1.2.4 細胞免疫熒光染色檢測EMT和基質成分相關分子的表達：將細胞經胰酶消化收集后分別以1× 105個細胞接種于含載玻片的六孔板中，細胞培養至70%融合后，分別用TGF-β 1和TGF-β 1聯用SSBE進行處理24 h，用4%多聚甲醛固定30 min，0.3% Triton-X（1 mL/孔）破膜，室溫20 min。0.5%正常山羊血清封閉。在各細胞爬片上滴加E-cadherin、α-SMA和Col3a1一抗工作液，4 ℃孵育過夜。滴加Dylight488（綠色）或594（紅色）標記的二抗工作液，37 ℃孵育60 min。滴加DAPI于蓋玻片上，室溫染色5 min。細胞胞質綠色或紅色和胞核藍色為陽性著色。每組取3張片，每張片子取10個高倍視野，運用Image Pro Plus軟件分析平均光密度值。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS15.0統計學軟件。計量數據以±s表示，兩組樣本比較采用t檢驗和精確概率法，多組間樣本比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SSBE抑制TGF-β1誘導NRK-52E細胞的形態改變

相差顯微鏡下，對照組NRK-52E細胞培養24 h后呈現鋪路石狀，細胞結合緊密，細胞間隙不明顯（見圖1）；5μg/L的TGF-β 1的誘導下，NRK-52E細胞呈梭形或不規則形狀，細胞間隙拉大；在TGF-β 1基礎上用10 mg/L的SSBE干預后，梭形細胞有所改善，細胞間隙縮小；當SSBE濃度增加到100 mg/L后，細胞形態恢復到鋪路石狀，細胞間隙減小，相互間結合緊密。這些結果提示SSBE抑制了TGF-β 1誘導的小管上皮細胞纖維樣改變，并呈現濃度依賴性。

2.2 SSBE抑制TGF-β1誘導的EMT和基質累積 免疫熒光染色結果顯示，5 μg/L TGF-β 1的作用下，NRK-52E細胞中上皮細胞標志物E-cadherin蛋白的表達水平明顯下調，而MFs標志物α-SMA的表達水平明顯升高，見圖2。此外，TGF-β 1也促進了基質成分Col3a1蛋白的表達。Real-time RT-PCR結果顯示，TGF-β 1抑制了緊密連接蛋白Tjp1 mRNA的表達，促進了α-SMA、Col1a1和Col3a1 mRNA的表達（見圖3）。應用10和100 mg/L SSBE干預后，TGF-β 1誘導的這些EMT改變以及基質累積均被抑制，并且其抑制作用呈現濃度相關性。

圖1 SSBE對TGF-β 1作用下NRK-52E細胞形態的影響（×200）

圖2 SSBE對TGF-β 1作用下NRK-52E細胞EMT和膠原累積的影響（×200）

圖3 SSBE對TGF-β 1誘導的EMT和基質累積相關基因表達的影響

2.3 SSBE逆轉TGF-β1誘導的BMP-7高表達 以前研究顯示，TGF-β 1誘導的EMT反應可被BMP-7所逆轉，BMP-7表達下降可能是EMT形成重要的原因之一[4]。因此，我們評價了SSBE對BMP-7的影響。Real-time RT-PCR結果顯示，在TGF-β 1作用后，NRK-52E細胞中BMP-7 mRNA的表達水平顯著下調；而SSBE干預后，BMP-7 mRNA的表達水平恢復（見圖4A）。

2.4 SSBE恢復TGF-β1誘導的MMP-2/TIMP-2失衡

MMP-2及TIMP-2是體內基質成分合成和降解重要的調節因素[5]。MMP-2/TIMP-2比例一旦降低，說明基質合成速度超過降解速度，導致基質累積和纖維化。本研究中，TGF-β 1雖同時上調了MMP-2和TIMP-2 mRNA表達水平，但上調TIMP-2 mRNA的程度高于MMP-2，從而導致其比例降低（見圖4B-C）。而應用SSBE干預后，盡管MMP-2和TIMP-2 mRNA表達水平均下調，但TIMP-2 mRNA的表達水平下降更為嚴重。這些結果提示SSBE恢復了TGF-β 1誘導的MMP-2/TIMP-2失衡，從而改善基質成分累積程度。

圖4 SSBE干預TGF-β1對BMP-7、MMP2和TIMP-2 mRNA表達的影響

3 討論

根據功能學和形態學分類，可將腎組織分為上皮和間葉兩種細胞類型，每一種都有其特有的功能。上皮細胞是多細胞結構，由緊密連接的細胞組成，并緊密黏附于基底膜表面。間葉細胞（主要為MFs）則為連接疏松的細胞，主要存在于細胞外基質，它們自己產生并有非常強的遷移能力。現今越來越多的證據證明上皮細胞能通過EMT改變其表型獲得MFs的特征，使其增加移動和合成基質成分，如Col1a1 和Col3a1等[2]。EMT通常見于胚胎生長期組織形態形成和腫瘤的生長過程。然而，在惡劣或損傷微環境中，上皮細胞可以通過EMT，使其獲得適應環境的表型，參與損傷后組織修復和纖維化[5]。在機體內，多種因素均可導致EMT的發生，如促纖維因子TGF-β 1表達的升高，BMP-7表達的下調等[6-7]。本實驗中，我們應用TGF-β 1作用腎小管上皮細胞后，小管上皮細胞出現纖維樣改變，NRK-52E細胞表達上皮細胞標志物E-cadherin和Tjp1減少，而表達MFs標志物α-SMA增多，基質成分Col1a1和Col3a1表達增加，這些結果提示TGF-β 1誘導了EMT的發生。應用SSBE干預后，小管上皮細胞EMT轉變得到緩解，并且拮抗EMT作用的BMP-7表達也隨之升高。因此，這些結果提示SSBE能拮抗TGF-β 1誘導的EMT和腎纖維化作用。

SSBE為垂盆草的回流提取物[8]，而后者屬于景天科多年生草本植物，是中國藥典記載的常用中藥之一，具有清利濕熱、解毒功效。考慮到SSBE是一種多組分的混合物，是否是由于其內組分的作用而影響其效應呢？我們前期通過高效液相色譜法測定其成分，發現SSBE中含有槲皮素、山萘酚、異鼠李素、木犀草素和異甘草素等，其中槲皮素含量最高。槲皮素又名櫟精，具有降低血壓、增強毛細血管抵抗力、減少毛細血管脆性、降血脂等作用。此外，槲皮素也具有抗腫瘤和抗纖維化的作用，并且這種抗纖維化作用主要是通過調控MMP-2的表達來實現[9]。本研究中，我們也分析了SSBE對MMP-2及其抑制因子TIMP-2表達的影響。結果發現SSBE恢復了由于TGF-β 1所致的MMP-2/TIMP-2比值下調，說明SSBE抑制了MFs合成基質，促進其降解。基于上述證據，推測SSBE的抗纖維化作用可能與其主要組分槲皮素存在一定的相關性。

綜上所述，我們從體外實驗角度證實了SSBE能拮抗TGF-β 1誘導的EMT效應，抑制基質合成，促進降解，進而發揮抗腎纖維化作用。在未來的工作，我們將評價SSBE各組分對于小管上皮細胞EMT以及腎纖維化的作用，并且深入探索其可能的分子機制，為今后纖維化類疾病的中草藥治療提供理論依據。

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（本文編輯：吳健敏）

Effect of Sedum sarmentosum Bunge Extract on TGF-β1-induced renal epithelial-to-mesenchymal transi- tion and matrix accumulation

YANG Rongrong1,LU Hong1,WU Lianfeng1,WANG Silu2,LIN Chengcheng2,LIANG Yong2,BAI Yongheng2.
1.Department of Laboratory Medicine,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Wenzhou Key Laboratory of Surgery,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Objective:To investigate the protective effects of Sedum sarmentosum Bunge Extract (SSBE) on TGF-β1-induced epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and matrix accumulation in renal tubular epithelial cells (NRK-52E).Methods:NRK-52E cells were divided randomly into:control group treated with only solvent,TGF-β1 group treated with TGF-β1 at the concentrations with 5 μg/L and SSBE group treated with TGF-β1 plus SSBE at the concentrations with 10 and 100 mg/L.The morphology of the NRK-52E cells was observed under inverted/phase contrast microscope.Immunofluorescent analysis was performed to detect the expression of epithelial marker α-smooth muscle actin (α-SMA),mesenchymal marker E-cadherin,and matrix component type III collagen.Gene expression of α-SMA,bone morphogenic protein-7 (BMP-7),tight junction protein-1 (Tjp1),Col1a1,Col3a1,MMP-2,and TIMP-2 were also quantified by real-time RT-PCR.Results:In TGF-β-treated NRK-52E cells,fibrosis-like phonotype was obviously increased.TGF-β1 increased the expression of α-SMA,and decreased the expression of E-cadherin and Tjp1.Also,TGF-β1 enhanced the expression of type I and III collagens.Treatment with SSBE at the concentrations with 10 and 100 mg/L inhibited TGF-β1-induced fibrosislike phenotype of NRK-52E cells,accompanied with down-regulated expression of α-SMA,Col1a1 and Col1a1 and up-regulated expression of E-cadherin and Tip1.In addition,SSBE increased the expression of BMP-7 and the ratio between MMP-2 and TIMP-2.Conclusion:SSBE treatment reduce TGF-β1-induced fibrosis-like reaction in renal tubular epithelial cells through inhibiting EMT and matrix accumulation.

Sedum sarmentosum Bunge Extract; TGF-β1; epithelial-to-mesenchymal transition; matrix accumulation

R730.52

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.04.003

2014-09-11

浙江省自然科學基金資助項目（LQ12H05001）；溫州市科技計劃項目（Y20110028，Y20140023）。

楊嫆嫆（1961-），女，浙江樂清人，主管技師。

白永恒，主管技師，Email：greatsailor@163.com。