β-內酰胺酶E166C突變型的原核表達、純化及鑒定

【軍事醫學與衛生裝備】

β-內酰胺酶E166C突變型的原核表達、純化及鑒定

肖美芳，王昌富，周義正，邱曉燕

(華中科技大學附屬荊州醫院, 湖北 荊州434020)

摘要：目的本研究旨在構建β-內酰胺酶E166C突變體并于大腸桿菌中原核表達，純化及鑒定該蛋白。方法利用體外PCR擴增獲得β-內酰胺酶penP突變質粒并通過DNA測序鑒定，將重組質粒轉化至BL21(DE3) 中，以IPTG 誘導蛋白表達。菌液超聲裂解后首先以鎳柱純化融合蛋白，蛋白水解酶 HRV3C 除去融合標簽，然后用凝膠過濾層析色譜進一步純化得到目標蛋白，最后應用SDS-PAGE和電噴霧質譜法鑒定純化的目標蛋白。結果成功構建了β-內酰胺酶penP-E166C突變質粒，并且先后通過親和鎳柱和凝膠過濾層析柱純化獲得了純度非常高的單一蛋白，SDS-PAGE和電噴霧質譜法確定蛋白的分子量與理論值一致。結論本課題獲得的penP的活性位點突變體E166C蛋白將用于以后進一步的研究，可以有助于我們從分子水平上去研究抗生素和β-內酰胺酶的相互作用。

關鍵詞：β-內酰胺酶E166C突變體；PCR-介導的定點突變；蛋白純化及鑒定

收稿日期：2015-01-12

作者簡介：肖美芳(1982—)，女，碩士研究生。主要從事細菌耐藥性研究。

doi:10.11809/scbgxb2015.06.039

中圖分類號：R961

文章編號：1006-0707(2015)06-0153-05

本文引用格式：肖美芳，王昌富，周義正，等.β-內酰胺酶E166C突變型的原核表達、純化及鑒定[J].四川兵工學報，2015(6):153-156.

Citationformat:XIAOMei-fang,WANGChang-fu,ZHOUYi-zheng,etal.ProteinExpression,PurificationandIdentificationofβ-LactamasePenP-E166CWildtypeandMutants[J].JournalofSichuanOrdnance,2015(6):153-156.

ProteinExpression,PurificationandIdentificationof

β-LactamasePenP-E166CWildtypeandMutants

XIAOMei-fang,WANGChang-fu,ZHOUYi-zheng,QIUXiao-yan

(JingzhouCentralHospitalAffiliatedtoHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Jingzhou434020,China)

Abstract:Objective This study was aimed to construct β-lactamase penP-E166C mutant and over-express it in E.coli, followed by purification and characterization. Method The plasmid of mutated β-lactamase penP was successfully amplified by PCR-mediated mutagenesis, which was then confirmed by DNA sequencing. The confirmed plasmids were firstly transformed into competent BL21(DE3) cells and the positive colonies were selected by antibiotics kanamycin, which were then induced by the addition of IPTG. The bacterial cells were firstly liaised by sonication, followed by Ni2+-affinity column purification, protease 3C digestion and gel filtration column purification to obtain target protein. The proteins were characterized by SDS-PAGE and ESI-mass spectrometry. Results We successively constructed penP-E166C mutant and purified this protein by Ni2+-affinity column and gel filtration column. SDS-PAGE and ESI-mass spectrometry further identified the protein molecular weight was consistent with theoretical value. Conclusion The obtained penP-E166C protein with mutation at the active site will be used in later study, which will help us to understand the interaction between antibiotics and β-lactamase better.

Keywords:β-lactamase-penPmutant;PCR-mediatedpointmutagenesis;proteinpurificationandcharacterization

β-內酰胺類抗生素 (β-lactamantibiotics)由于抗菌作用強，毒性低是目前臨床抗感染治療最普遍的一類抗生素。β-內酰胺類抗生素可以不可逆地結合到青霉素結合蛋白(PBPs的活性部位，而使其失活。由于PBPs是一組細菌細胞壁合成的關鍵酶，抑制其活性就會然阻斷細菌細胞壁的合成，導致細菌滲透裂解然后死亡[1,2]。β-內酰胺類抗生素的優勢是它可以選擇性的作用于快速分裂的細菌，而作為宿主的人類細胞因為沒有細胞壁就會不受影響。隨著抗生素的廣泛使用(尤其是吳用和濫用)以及致病菌的進化，使得耐藥性傳染病菌不斷涌現和全球蔓延，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)[3]。最近，數株肺炎克雷伯菌更被確定為具有超廣譜抗性，幾乎可以抵抗所有的β-內酰胺類抗生素，甚至包括“最后的”防線碳青霉烯類抗生素[4]。這些所謂“超級病菌”的耐藥菌株，由于治療難度很高，導致住院時間延長并增加感染的廣泛傳播的機會，從而給醫療保健系統帶來巨大的風險。

細菌可以通過多種方式獲得對β-內酰胺抗生素抗藥性，包括突變青霉素結合蛋白(PBP)的活性位點，使β-內酰胺不能結合到它的作用靶點;或者是增加外排，泵出侵入細菌的抗生素；又或是表達β-內酰胺酶來使抗生素失活[5,6]。其中，β-內酰胺酶的產生是最重要的，也是最多被研究細菌耐藥性的機制。β-內酰胺酶可以通過細菌染色體嵌入基因或者是通過水平基因轉移而獲得，這些酶可以水解抗生素獨特的β-內酰胺環，使他們不能有效結合到PBPs而失去活性。研究表明，雖然β-內酰胺酶的總數高得驚人并在不斷增長，但是這些酶的許多成員之間可能只有很小的差別，只有一個或幾個熱點氨基酸殘基發生了突變，從而導致β-內酰胺酶活性中心的構象發生改變，繼而其作用底物譜也發生改變[7]。

penP，TEM-1和SHV-1系列是A類β-內酰胺酶的典型代表，其與90%革蘭陰性菌對青霉素耐藥性相關[8]。penP，其與TEM-1和SHV-1的序列相似性高，熱穩定性高(Tm～ 65 ℃) ，使得它可以廣泛用于突變與酶結構，酶活性關系方面的研究[6-7]。氨基酸殘基E166是β-內酰胺酶penP的關鍵活性位點，其作為一般堿，與酶的水解活性密切相關[8]。本研究擬構建penP-E166C的突變質粒并純化突變體蛋白，為今后的結構生物學實驗提供蛋白來源。結構生物學實驗將會進一步弄清影響β-內酰胺酶活性的關鍵氨基酸殘基提供實驗基礎，為將來設計β-內酰胺酶抑制劑，逆轉抗生素廣譜耐藥性提供重要的理論依據[9]。

1材料與方法

1.1菌株與質粒

感受態大腸桿菌DH5α和BL21DE3 購買自Invitrogen，包含Penp全長序列的質粒pRset-K_6xHis_TEV_PenP由本科室保存。

1.2主要儀器與試劑

梯度PCR儀( 美國Bio-Rad公司)， 瓊脂糖水平電泳儀( 北京市六一儀器廠)，凝膠掃描成像系統( 美國Bio-Rad公司)，蛋白質垂直電泳槽( 美國Bio-Rad公司) ，臺式高速冷凍離心機( 德國Eppendorf公司)，His-trapHP型鎳離子親和層析柱(美國GE公司)，HiLoad16/60,superdex75 凝膠過濾色譜柱 (美國GE公司)，AKTA快速蛋白純化色譜儀(美國GE公司)。

PhuDNA聚合酶，BamHI,EcoRI限制性內切酶、T4DNA連接酶均為Fermentas產品、、瓊脂糖凝膠DNA回收，質粒提取試劑盒購自上海桑尼生物科技有限公司產品。引物合成、質粒測序均委托北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.3PCR介導的Penp基因體外定點突變

以pRset-K_6xHis_TEV_PenP為模板和table1中所列的引物，QuickChangeSite-DirectedMutagenesis試劑盒(Strategene)進行PCR介導的體外定點突變。PCR組分和反應程序見table2 和table3.PCR結束后加入1μLDpnⅠ酶消化原始模板。將消化后產物直接轉化大腸桿菌感受態細胞E.coliDH5α,以含50μg/mL卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，突變子最終通過測序確定。

表1　引物列表

表2　 PCR反應各組分配比

表3　 PCR(聚合酶鏈式反應)反應程序

1.4重組蛋白質的誘導表達

將測序鑒定正確的突變型pRset-K_6xHis_TEV_PenP_E166C質粒轉化大腸桿菌感受態細胞BL21DE3，37℃過夜培養后挑取單菌落到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基，37 ℃,250rpm孵育過夜。次日，按1∶100的比例接種至新鮮的含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中培養至A600nm=0.5～0.7時，加入終濃度為0.5mmol/L的異丙基-β-D硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，30 ℃誘導培養4h，離心收集菌體，置-80℃備用。

1.5Penp蛋白的純化

1.5.1His-Trap親和柱純化融合蛋白6xHis_TEV_PenP_E166C

離心收集完成誘導的菌體，以50mL的冰預冷緩沖液(50mMTris,150mMNaCl,pH8.0,1mMPMSFand10mMbeta-mecaptoethanol,) 重懸菌體。冰浴超聲裂菌20min，使融合蛋白完全釋放。將超聲破碎后的菌體懸液以20 000rpm/min4℃離心1h，收集上清，利用AKTA-FPLC系統純化。首先將裂解上清液上到5mLHis-trapHP親和柱上，然后用20倍柱體積平衡液(20mMsodiumphosphate,500mMNaCl,40mMimidazole,pH7.4)清洗純化柱，再用洗脫液(20mMsodiumphosphate,500mMNaCl,500mMimidazole,pH7.4)洗脫6xHis_TEV_PenP_E166C融合蛋白。

洗脫液用超濾離心管濃縮至4mL，然后加入100μL蛋白水解酶TEV4℃酶切。酶切反應溶液再次上樣到親和色譜柱，6XHis標簽將結合到鎳柱，而目標蛋白將隨washbuffer流出，收集含有目標蛋白的流出液，并濃縮樣品至2mL。

1.5.2凝膠過濾層析色譜純化目標蛋白PenP_E166C

首先，HiLoad16/60,superdex75層析柱連接到AKTA蛋白純化系統，先后用120mL去離子水和緩沖液(50mMTris-Hcl,150mMNaCl,PH8.0)平衡；然后將2mL酶切后的樣品上樣，用上述緩沖液洗脫，洗脫速度為1mL/min，根據洗脫液的紫外吸收信號自動收集洗脫組分。目標組分濃縮，封裝，液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

2實驗結果

2.1Penp—E166C突變體的構建和鑒定

以pRset-K_6xHis_TEV_PenP質粒為模板，分別利用攜帶突變堿基的引物對(table1)，經PCR-介導的體外定點突變方法，獲得目的片段約6kb大小的PCR產物。DpnI降解模板后轉化感受態大腸桿菌DH5α，陽性單克隆抽提的質粒測序結果用Expasytranslate工具翻譯成氨基酸序列(圖1)顯示突變體成功構建。

圖1　6 xHis_TEV_PenP_E166 C的蛋白質序列

2.26 xHis_TEV_PenP_E166 C 融合蛋白的表達和純化

利用pRset-K載體表達外源蛋白時，融合蛋白N端含有6XHis標簽，可以利用Ni-NTA層析柱進行純化。表達菌破碎后上清經親和層析得到唯一的洗脫峰(圖2)即為 6xHis_TEV_PenP融合蛋白。蛋白樣品經12%SDS-PAGE電泳分析(圖3)，蛋白分子量經質譜檢測為31.225kDa，與理論值一致(圖4)。

親和色譜柱為 GE公司的 HiTrap鎳柱，檢測波長為280 nm。

泳道1是低范圍分子量標記;泳道2是上樣到柱上之前的樣品;泳道3經由色譜柱流出的樣品;泳道4是從柱上洗出未結合的蛋白;泳道5至10分別從柱上洗脫下來的不同組分

圖312%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析親和層析

過程中的每個樣品

圖4　融合蛋白6 xHis_TEV_PenP_E166 C的質譜圖

2.3目標蛋白 Penp_E166 C的純化

由于在6XHis標簽和目標蛋白PenP之間存在著proteaseTEV的酶切位點，可以利用TEV蛋白水解酶切下6XHis標簽,酶切反應時間通過SDS-PAGE檢測，發現6小時后反應完全基本水解 (圖5)。酶水解反應物再一次通過Ni-NTA層析柱進行純化，從而6XHis標簽結合到親和柱，而目標蛋白被洗脫(圖6)。洗脫液濃縮后進一步通過凝膠過濾層析色譜柱,目標蛋白以單一峰從凝膠色譜柱上洗脫出來(圖7),質譜結果顯示蛋白的分子量為29.607Kda(圖8),與理論分子量一致。

泳道1是低范圍分子量標記；泳道2是未裂解的融合蛋白；泳道3至5分別是2、4、6小時酶切的樣品

圖512%聚丙烯酰胺凝膠電泳監測TVE不同時間點

酶切6xHis-TEV-penP的過程

圖6　目標蛋白 TEV_PenP_E166 C的洗脫曲線

圖7　目標蛋白 TEV_PenP_E166 C凝膠過濾層析曲線

圖8　目標蛋白 PenP_E166 C的質譜圖

3結論

本研究主要涉及β-內酰胺酶PenP的突變體PenP_E166C的質粒構建、原核表達、純化和鑒定。利用PCR-介導的體外定點突變獲得pRset-K_6xHis_TEV_PenP_E166C質粒，將其轉化入大腸桿菌BL21(DE3)中，經IPTG誘導，超聲裂解細菌后經Ni-NTA親和柱層析柱獲得融合蛋白6xHis_TEV_PenP_E166C，經TEV水解去除融合標簽6xHis，經gelfiltration凝膠過濾層析色譜柱獲得目標蛋白PenP_E166C。證實了在大腸桿菌表達系統中表達并獲得高純度PenP_E166C蛋白的可行性。

隨著抗生素的使用日益增多，新的廣譜β-內酰胺酶在世界各地不斷被發現，其衍變規律還有待于進一步揭示。從分子水平上對β-內酰胺酶與抗生素相互作用的機制、產酶基因的結構和功能進行更深入研究。本課題獲得的penP的活性位點突變體E166C，將用于培養酶-抗生素復合物的蛋白晶體，用X-射線晶體衍射儀分析復合物的三維結構[10]。此研究將從分子水平解釋了靶標和藥物之間的相互作用模式，對基于該靶標設計新型β-內酰胺類抗生素的研究起著重大作用。同時這些研究方法和結果對今后進一步研究其他型β-內酰胺酶家族以及其與β-內酰胺類抗生素尤其是第3代、第4代頭孢菌素和單酰胺環類抗生素的相互作用機理提供了新的思路，也為解決臨床新型抗生素的設計問題提供了參考[11]。

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(責任編輯何杰玲)