TNF-α基因308位點單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性肺癌相關性研究*

孫永林 李穎 李永文 吳志浩 范亞光 劉紅雨 陳軍

·臨床研究與應用·

TNF-α基因308位點單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性肺癌相關性研究*

孫永林①李穎②李永文②吳志浩②范亞光②劉紅雨②陳軍①

目的：腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因啟動子單核苷酸多態(tài)性與某些炎性疾病、腫瘤的發(fā)生有關。本研究就TNF-α-308G/A位點基因多態(tài)性與中國人群原發(fā)性肺癌易感性進行探討。方法：應用高通量TaqMan-MGB探針技術對TNF-α-308G/A位點，即rs1800629位點進行基因分型，分析比較447例健康對照者和250例原發(fā)性肺癌患者的基因類型。采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)資料進行統(tǒng)計分析。結果：TNF-α-308G/A位點GG基因型在病例組和對照組中的頻率分別為73.2%和90.8%。A/G基因型在病例組和對照組中頻率分別為26.8%和8.7%。基因型A/G+AA頻率分別為26.8%和9.2%，該位點多態(tài)性在病例組和對照組中的分布頻率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，A/G基因型在男性、吸煙、小細胞肺癌或非小細胞肺癌患者相對于GG型均為危險因素，但在女性中無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：TNF-α-308G/A位點基因多態(tài)性與中國原發(fā)性肺癌發(fā)病易感性顯著相關。

腫瘤壞死因子-α基因 單核苷酸多態(tài)性 原發(fā)性肺癌 小細胞肺癌 非小細胞肺癌

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，是人類可遺傳變異中最常見的一種。本研究主要分析中國人群中腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）基因啟動子上游-308位點，即rs1800629位點多態(tài)性與原發(fā)性肺癌易感性的關系。TNF-α基因位于染色體6P21.4，全長為3.6 kbp，由4個外顯子和3個內含子組成，與主要組織相容性復合體（major his?tocompatibility complex，MHC）基因緊密連鎖位于MHC3類基因區(qū)內，為TNF超家族重要成員之一，能產(chǎn)生炎癥細胞因子，從而起始和調控炎癥細胞因子的產(chǎn)生。人類疾病細胞因子基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫中，其啟動子區(qū)238、308、857、863、1 031等8個位點位存在單核苷酸多態(tài)性，而TNF-α啟動子區(qū)多態(tài)性被認為可調節(jié)TNF-α的轉錄水平，有研究報道TNF-α基因-308位點單核苷酸多態(tài)性可能與慢性阻塞性肺病［1］、淋巴瘤［2-4］、類風濕性關節(jié)炎［5］、肉狀瘤病［6］以及Ⅱ型糖尿病［7］的發(fā)病易感性有關系。本研究采用Taqman基因分型技術，檢測中國人群中447例健康者與250例原發(fā)性肺癌患者的TNF-α-308位點，即rs1800629位點的基因型，并分析比較健康者與原發(fā)性肺癌基因型的差異，探討TNF-α-308位點G/A多態(tài)性與中國人群原發(fā)性肺癌易感性的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

447例健康對照者均來自2007年1月至2010年1月天津醫(yī)科大學總醫(yī)院肺部腫瘤外科健康查體門診，其中男性275例，女性172例，年齡范圍22～84歲，中位年齡54歲。全部研究對象均為隨機選取，無血緣關系。250例肺癌患者均來自天津醫(yī)科大學總醫(yī)院肺部腫瘤外科原發(fā)性肺癌手術患者，其中男178例，女72例，年齡范圍32～84歲，中位年齡61歲。全部研究對象均為隨機選取，無血緣關系。本研究經(jīng)院倫理委員會審批同意。研究對象的基本情況見表1。

1.2 方法

1.2 1 人外周血白細胞基因組DNA抽提 取對照者或患者清晨空腹靜脈血5 mL，EDTA抗凝，以DNA抽提試劑盒（德國Qiagen公司）抽提血DNA。紫外分光光度計檢驗其濃度后標準化至50 ng/μL，-80oC冰箱中備用。

1.2.2 基因多態(tài)性分析 基因多態(tài)性分析采用Taqman基因分型技術，使用的Pre-desighed Taqman SNP基因分型探針rs1800629、PCR體系中所使用的PCR引物和Master Mix均購于美國應用生物系統(tǒng)公司，取2.5 μL的DNA模板與2×TaqMan Genotyping Master Mix 2.5 μL，40×TaqMan SNPGenotyping Assay 0.125 μL混合充分。質控：每次實驗均設NTC（notemplate controls）以及陽性對照。RT-PCR的循環(huán)條件為：50oC 2 min，95oC 10 min，95oC 15s，60oC 1 min；循環(huán)50次。RT-PCR反應完成后進行后讀板，結果采用SDS 2.2 software分析。基因分型在Applied Biosys?tems（美國應用生物系統(tǒng)公司）7900HT Fast RTPCRPCR System 384孔板完成。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，用χ2檢驗比較病例組與對照組中年齡、性別、吸煙的分布情況，組間均數(shù)比較運用t檢驗。采用多因素Logistic回歸分析基因多態(tài)性與肺癌易感性的關聯(lián)。所有檢驗為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病例組和對照組基本情況比較

病例組和對照組的年齡差異和性別構成及吸煙狀況具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），病例組中年齡＞57歲的患者人數(shù)頻率顯著高于對照組（61.6%vs.40.7%）；男性患者人數(shù)頻率同樣高于對照組（71.2%vs. 61.5%）；病例組吸煙人數(shù)頻率顯著高于對照組（63.6%vs.34.2%，表1）。

表1 對照組與病例組的基本情況 例（%）Table 1 General characteristics of the case group and the control group n（%）

2.2 TNF-α-308G/A位點各基因型的頻率分布以及與肺癌發(fā)病危險關系分析

基因型GG在病例組和對照組中的頻率分別為73.2%和90.8%，基因型A/G在兩組中的頻率分別為26.8%和8.7%，基因型A/G+AA在病例組及對照組中的比例分別為26.8%和9.2%。以基因型G/G作為對照，該位點基因型A/G的調整危險度為3.707（95%CI：2.414～5.692，P＜0.05），基因型A/G+AA的調整危險度為3.530（95%CI：2.312-5.392，P＜0.05）。表明TNF-α-308G/A基因型在肺癌患者和健康者中的分布頻率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），基因型A/G與AA在病例組和健康組中相對于GG為原發(fā)性肺癌的危險因素（表2）。

2.3 TNF-α基因-308G/A位點各基因型不同分層后與肺癌發(fā)病危險關系分析

為消除年齡、性別、吸煙的混雜影響，進一步對TNF-α-308G/A基因位點各基因型按性別、吸煙進行分層分析，并對308G/A位點多態(tài)性與不同病理類型肺癌的關聯(lián)進行了分析（表3～5）。根據(jù)性別將研究人群分為男性和女性兩組，分析發(fā)現(xiàn)，此位點在男性中基因型A/G的OR值為4.15（95%CI：2.43～7.08，P＜0.05），A/G+AA OR值為4.90（95%CI：2.74～8.77，P＜0.05），為原發(fā)型肺癌的危險因素，但在女性中無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）；此外，根據(jù)吸煙史將研究人群分為不吸煙和吸煙組，在吸煙中基因型A/G的OR值為5.93（95%CI：2.88～12.28，P＜0.05），A/G+ AA型OR值為5.93（95%CI：2.88～12.28，P＜0.05），有統(tǒng)計學意義，在非吸煙中基因型A/G的OR值為2.39（95%CI：1.20～4.75，P＜0.05），A/G+AA型OR值為2.26（95%CI：1.15～4.46，P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（表4），基因型A/G和A/G+AA在吸煙人群中相對于GG是肺癌發(fā)病的危險因素，基因型A/G和A/G+AA在非吸煙人群中相對于GG也屬于肺癌發(fā)病的危險因素。根據(jù)病理類型將研究對象分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩組人群，基因型A/G與A/G+AA在小細胞肺癌中OR值分別為5.62（95%CI：2.06～15.34，P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義，在非小細胞肺癌中A/G與A/G+AA基因型OR值為3.67（95%CI：2.25～5.97，P＜0.05，表5），A/G和A/G+AA基因型在小細胞肺癌和非小細胞肺癌中相對于GG型均為肺癌發(fā)病的危險因素。

表2 TNF-α-308G/A基因多態(tài)性與肺癌發(fā)病危險關系分析例（%）Table 2 Association between the SNP of the TNF-α gene and the risk for lung cancer n（%）

表3 不同性別患者TNF-α-308G/A位點與肺癌發(fā)病風險的關聯(lián)Table 3 TNF-α-308G/A SNP in the lung-cancer group and the control group for different genders

表4 不同吸煙狀態(tài)下TNF-α-308G/A位點與肺癌發(fā)病風險的關聯(lián)Table 4 TNF-α-308G/A SNP in the lung-cancer group and the control group for different smoking status

表5 308G/A與不同組織類型肺癌發(fā)病風險的相關性Table 5 308G/A SNP in the lung-cancer group and the control group for different pathologic types

3 討論

肺癌是目前全球范圍內對人類生命威脅最大的惡性腫瘤之一，關于肺癌的病因學、預防、診斷、治療已經(jīng)成為全世界的重要課題，流行病學研究表明肺癌的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結果，盡管80%以上的肺癌可歸咎于煙草暴露［8］，但在相同的煙草暴露下，僅不到20%的吸煙者發(fā)展為肺癌［9］，提示不同個體對肺癌存在遺傳易感性。SNP是目前為止分布最為廣泛、存在數(shù)量最多的一種遺傳多態(tài)性，其在基因序列中的高密度、代表性、遺傳穩(wěn)定性以及易檢測等特點體現(xiàn)了新一代遺傳標記的優(yōu)越性，使其被迅速接受從而成為遺傳研究領域中極為活躍的內容。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個基因的多態(tài)位點與肺癌的發(fā)生、發(fā)展、治療及預后有相關性［10-11］，為探討肺癌發(fā)生的分子基礎提供了很好的依據(jù)。本研究分析了TNF-α基因位點多態(tài)性與原發(fā)肺癌發(fā)病的關系，采用Taqman技術，分析了大樣本的TNF-α-308G/A基因型多態(tài)性位點與肺癌易感性的關系。TNF-α基因啟動子區(qū)多態(tài)性可調節(jié)TNF-α的轉錄水平。同時TNF-α基因與MHC基因緊密連鎖位于MHC3類基因區(qū)內，處于連鎖不平衡狀態(tài)，MHC對某些疾病有重要影響，這可能是TNF-α基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生的分子基礎。

本研究表明TNF-α-308G/A基因型在肺癌患者和健康者中的分布頻率差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這一點與相關研究結果相似，基因型A/G與A/G+AA相對于GG為原發(fā)性肺癌的危險因素［12］。進一步的分層分析發(fā)現(xiàn)此位點在男性中基因型A/G和A/G+AA相對于GG為原發(fā)型肺癌的危險因素，而在女性中無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；此外，A/G和AA在吸煙和非吸煙人群中相對于GG是肺癌發(fā)病的危險因素。基因型A/G與A/G+AA在小細胞肺癌和非小細胞肺癌中相對于GG均為肺癌發(fā)病的危險因素。因此，在男性、吸煙與非吸煙的各種組織類型的原發(fā)性肺癌中，TNF-α-308G/A位點A/G和AA型相對于GG型，依然是肺癌發(fā)病的危險因素。而在女性患者中基因型A/ G和AA型相對于GG型并沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05），可能與樣本量、研究對象的選擇有關。

綜上所述，在肺癌的發(fā)生過程中TNF-α-308G/A多態(tài)性位點可能對肺癌的易感性產(chǎn)生一定的影響。充分考慮腫瘤多影響因素的復雜過程，可為全面了解肺癌病因提供科學依據(jù)。

[1] Hung RJ,McKay JD,Gaborieau V,et al.A susceptibility locus for lung cancer maps to nicotinic acetylcholine receptor subunit genes on 15q25[J].Nature,2008,452(7187):633-637.

[2] Bel HJB,Chatti A,Laatiri A,et al.Tumor necrosis factor promoter gene polymorphism associated with increased susceptibility to non-Hodgkin's lymphomas[J].Eur J Haematol,2007,78(2):117-122.

[3] Cerhan JR,Liu-Mares W,Fredericksen ZS,et al.Genetic varia?tion in tumor necrosis factor and the nuclear factor-kappaB ca?nonical pathway and risk of non-Hodgkin's lymphoma[J].Can?cer Epidemiol Biomarkers Prev,2008,17(11):3161-3169.

[4] Wang SS,Cerhan JR,Hartge P,et al.Common genetic variants in proinflammatory and other immunoregulatory genes and risk for non-Hodgkin lymphoma[J].Cancer Res,2006,66(19):9771-9780. [5]O'Rielly DD,Roslin NM,Beyene J,et al.TNF-alpha-308 G/A polymorphism and responsiveness to TNF-alpha blockade therapy in moderate to severe rheumatoid arthritis:a systematic review and meta-analysis[J].Pharmacogenomics J,2009,9(3):161-167.

[6] Medica I,Kastrin A,Maver A,et al.Role of genetic polymor?phisms in ACE and TNF-alpha gene in sarcoidosis:a meta-anal?ysis[J].J Hum Genet,2007,52(10):836-847.

[7] Boraska V,Rayner NW,Groves CJ,et al.Large-scale associa?tion analysis of TNF/LTA gene region polymorphisms in type 2 diabetes[J].BMC Med Genet,2010,11:69.

[8] Peto R,Lopez AD,Boreham J,et al.Mortality from smoking worldwide[J].Br Med Bull,1996,52(1):12-21.

[9] Alberg AJ,Samet JM.Epidemiology of lung cancer[J].Chest, 2003,123(1 Suppl):21S-49S.

[10]Gao H,Ge RC,Liu HY,et al.Effect of ERCC1 polymorphism on the response to chemotherapy and clinical outcome of nonsmall cell lung cancer[J].Genet Mol Res,2014,13(4):8997-9004.

[11]Brzoska K,Bartlomiejczyk T,Sochanowicz B,et al.Matrix metal?loproteinase 3 polymorphisms as a potential marker of enhanced susceptibility to lung cancer in chronic obstructive pulmonary dis?ease subjects[J].Ann Agric Environ Med,2014,21(3):546-551.

[12]Shih CM,Lee YL,Chiou HL,et al.Association of TNF-alpha polymorphism with susceptibility to and severity of non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer,2006,52(1):15-20.

（2015-05-15收稿）

（2015-06-29修回）

（編輯：楊紅欣）

Association between TNF-α-308 genetic polymorphisms and increased risk of primary lung cancer in Chinese population: a case-control study

Yonglin SUN1,Ying LI2,Yongwen LI2,Zhihao WU1,Yaguang FAN1,Hongyu LIU1,Jun CHEN2

1Department of Lung Cancer Surgery,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China;2Tianjin Key Laboratory of Lung Cancer Metastasis and Tumor Microenvironment,Tianjin Lung Cancer Institute,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China.
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81172233 and No.81372306),the Key Project of Tianjin Municipal Natural Science Foundation(No.12JCZDJC24400),Tianjin Municipal Natural Science Foundation (No.13JCYBJC22600),Tianjin Science and Technology Support Program(No.12ZCDZSY16100),and the Funds of Special Studies for China Ministry of Education Doctorship Conferring Unit(No.20131202110004).

Objective:Previous studies suggested that the-308G/A allele in the tumor necrosis factor-α(TNF-α)gene promoter (-308G/A)may be a potential risk factor for inflammatory diseases and tumor progression.However,only a few studies have focused on the-308 polymorphism of TNF-α gene with primary lung cancer in Chinese population.This study aims to evaluate the role of TNF-α-308G/A single nucleotide polymorphism(SNP)and the risk of primary lung cancer in Chinese population.Methods:A total of 250 patients and 447 healthy individuals(control group)were involved in this study.Genotyping was performed using TaqMan technology. Results:The frequencies of(GG),(A/G),and(A/G+AA)genotypes of-308G/A SNP in TNF-α gene were 183(73.2%),67(26.8%), and 67(26.8%)in the patients,and 406(90.8%),39(8.7%),and 41(9.2%)in the control group,respectively.The distribution of polymorphism frequencies in the case group and the control group showed a statistically significant difference for the Chinese population (P＜0.05).Conclusion:Results indicated that TNF-α gene polymorphism at position-308G/A is associated with susceptibility to lung cancer in Chinese Han population.

tumor necrosis factor-α gene,single nucleotide polymorphism,primary lung cancer,small cell lung cancer,nonsmall-cell lung cancer

10.3969/j.issn.1000-8179.20150554

①天津醫(yī)科大學總醫(yī)院肺部腫瘤外科（天津市300052）；②天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉移與腫瘤微環(huán)境實驗室

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81172233，81372306）、天津市自然科學基金重點項目（編號：12JCZDJC24400）、天津市自然科學基金

項目（編號：13JCYBJC22600）、天津市科委抗癌重大專項攻關計劃（編號：12ZCDZSY16100）和教育部博士點基金（編號：20131202110004）資助

陳軍 huntercj2004@yahoo.com

孫永林 專業(yè)方向為肺部腫瘤外科學研究。

E-mail：15620198787@163.com