HPLC測定中添加劑前處理方法的探討

孫偉，王榮榮，汪清美

（信陽農林學院 a生物技術系，b食品科學系，河南信陽 464000）

0 引言

近年來，食品添加劑在各類食品飲料中超范圍、超量使用，形成了消費領域的一股暗流。國家對山梨酸、苯甲酸、糖精鈉的使用都有明確的限量標準和檢測方法[1-2]。國標HPLC法只規定了汽水、果汁類、酒類飲料品中測定苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的前處理方法，而GB2760也未對其他類食品作規定。酸牛奶除含有大量的蛋白質外，還含有增稠劑、穩定劑等，給HPLC法測定這類樣品中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉帶來很多困難。

準確測定酸牛奶中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的含量，關鍵是快速、高效的沉淀蛋白質。常用的沉淀蛋白質的方法有：加熱、加堿或酸、加入氧化劑、離心、加重金屬鹽、加有機溶劑、加入濃的鹽溶液[3]。在實驗中傳統的處理方法是用亞鐵氰化鉀－乙酸鋅[4]來沉淀蛋白質。本文結合在文獻中曾報道過的4種化學沉淀劑，分別是：無水乙醇[5]、硫酸銅[6]、硫酸銅－氫氧化鈉[7]、高氯酸[8]，通過實驗與傳統方法相對比，尋求可替代傳統方法的沉淀劑。

1 實驗

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

SCL-10AVP高效液相色譜儀，帶紫外檢測器，N2000色譜工作站。旋渦混合器（QL-901）。00.45 μm濾膜，10 μL注射器。

1.1.2 試劑

苯甲酸（SB）、山梨酸（SA）糖精鈉（Sac）標準儲備液（質量濃度1.0 g/L）；甲醇、乙醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水，溶液為水溶液。

質量濃度為1.54 g/L乙酸銨溶液（稱取1.54g乙酸銨加水至1000 mL，溶解，經0.45μm濾膜過濾）；濃度為106 g/L亞鐵氰化鉀溶液（稱取10.6 g亞鐵氰化鉀加水至100 mL）；質量濃度為219 g/L乙酸鋅溶液（稱取21.9 g乙酸鋅加冰乙酸3 mL加水至100 mL）；質量濃度為20 g/L碳酸氫鈉溶液（稱取2 g碳酸氫鈉加水至100 mL）；濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液（稱取5.00 g硫酸銅加水至100 mL）；質量濃度為200 g/L硫酸銅溶液（稱取20 g硫酸銅加水至100 mL）；質量濃度為40 g/L氫氧化鈉溶液（稱取4 g氫氧化鈉加水至100 mL）。體積分數為5%高氯酸溶液（移取5 mL高氯酸加水至100 mL）；（1+1）氨水（氨水加等體積水混合）。

1.2 色譜分析條件

色譜柱為 VP-ODS，4.6mm×150mmC18色譜柱。流動相為甲醇∶乙酸銨溶液（0.02 mol/L）=5∶95（體積分數）；流速為1.0 mL/min；進樣量為10 μL。檢測器為紫外檢測器，波長230 nm，靈敏度0.2 AUFS。

1.3 樣品處理

1.3.1 106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液

稱取10.00 g樣品置于50 mL具塞比色管中，加少量的水，加質量濃度為106 g/L亞鐵氰化鉀溶液5.0 mL，質量濃度為219 g/L乙酸鋅溶液5.0 mL，用水定容至50 mL，搖勻。

1.3.2 5%硫酸銅溶液

稱取10.00 g樣品置于50 ml具塞比色管中，加少量的水，加質量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液10 mL，定容至50 mL，搖勻。

1.3.3 200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液

稱取10.00 g樣品置于50 mL具塞比色管中，加少量的水，加質量濃度200 g/L硫酸銅溶液8 mL，混勻，再加質量濃度為40 g/L氫氧化鈉溶液2 mL，用水定容至50 mL，搖勻。

1.3.4 體積分數5%高氯酸溶液

稱取10.00 g樣品置于50 mL具塞比色管中，加少量的水，加體積分數為5%高氯酸溶液10 mL，用水定容至50 mL，搖勻。

靜置30 min后，分別移取經上述處理過的樣品10 mL于離心機中，以轉速為4 000 r/min離心10 min，然后取上層清液經0.45 μm濾頭過濾，待儀器穩定后進行測定。

1.3.5 無水乙醇

稱取10.00 g樣品置于50 mL具塞比色管中，加無水乙醇定容至50 mL，搖勻。

1.4 標準曲線的制備

分別吸取苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準儲備液0，0.50，1.00，1.50，2.00 mL于10 mL容量瓶中加水定容到刻度。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準使用溶液質量濃度分別為 0，0.05，0.10，0.15，0.20 g/L，混勻后經0.45 μm濾頭過濾，進行測定，以濃度對應峰面積作線性回歸。

2 結果與討論

2.1 蛋白質沉淀劑的直觀比較

分別用質量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液、無水乙醇、質量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液、質量濃度200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、體積分數5%高氯酸溶液處理樣品，定容并搖勻。在靜止的30 min內觀察沉淀的情況，結果如表1所示。

表1 5種沉淀劑的沉淀結果（n=3）

由表1可以看出，用傳統方法質量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液沉淀蛋白質時間最短，速度最快，蛋白質沉淀較完全。無水乙醇沉淀蛋白質的速度較快。質量濃度200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、體積分數5%高氯酸溶液沉淀蛋白質的速度相近，次于無水乙醇。質量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液對蛋白質的沉淀速度最慢。

2.2 流動相配比的選擇

流動相中的甲醇起黑殺菌、防腐的作用，同時調節流動相的極性，改變組分出峰時間、分離效果，得到較好的圖譜；加入乙酸銨則是調節離子強度，使待測物的峰形不致變壞[9]。流動相中不同配比的甲醇與乙酸銨，會使苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的保留時間發生顯著的變化。增加甲醇的含量會使擴散效應減小，峰形尖銳，出峰時間提前，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的峰可能產生重疊；而減少甲醇的含量會使擴散效應增大，峰形較差，出峰時間變慢，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的分離效果較好。糖精鈉的保留時間對甲醇質量濃度最敏感，為了達到較好的分離效果和分離時間，本實驗采用國標[1,2]中色譜分析條件：甲醇∶乙酸銨溶液（質量濃度1.540 g/L）為（5∶95，體積比）。標準譜圖如圖1所示，由圖1可以看出，出峰的順序依次是苯甲酸、山梨酸、糖精鈉，保留時間分別是9.390，12.707，20.157 min。

圖1 標準譜圖

2.3 標準曲線與線性范圍

在選定的色譜分析條件下，得到苯甲酸、山梨酸、糖精鈉標準使用溶液濃度X與峰面積Y之間的工作曲線呈現良好的線性關系。苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的回歸方程和線性范圍如表2所示。

表2 標準曲線與線性范圍

2.4 回收率和精密度實驗

按照實驗選定的色譜分析條件，采用加標回收率的方法來評定方法準確度，向已知酸牛奶樣品中分別加入標準添加劑樣品，用以上5種方法沉淀蛋白質，測定加入后酸牛奶樣品中添加劑的質量分數，各三次，計算回收率，并分析相對標準偏差，結果如表3所示。

表3 回收率和精密度實驗結果 mg/kg

2.5 討 論

酸牛奶樣品預處理的關鍵在于如何完全除去蛋白質，且不影響測量結果，即尋找一種較為理想的沉淀劑。這里分別采用了常用的質量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液、無水乙醇、質量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液、質量濃度200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、體積分數5%高氯酸溶液來沉淀樣品中的蛋白質。從加標平均回收率和精密度實驗結果的來看，5種方法的回收率和精密度均符合測定要求。

質量濃度為50.0 g/L硫酸銅溶液沉淀蛋白質的速度最慢，所測的結果與傳統方法差距很大。質量濃度200 g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、體積分數5%高氯酸溶液沉淀蛋白質的速度較快，但是所測的數值與傳統方法有差距。而無水乙醇的沉淀速度僅次于質量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液，對待測物含量的影響相對于質量濃度200g/L硫酸銅－40 g/L氫氧化鈉溶液、5%高氯酸溶液、質量濃度為50.0g/L硫酸銅溶液較小，與用傳統方法質量濃度106g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液測得的數值最相近，精密度高，實驗結果的重現性好，但是在樣品離心時需要用具塞離心管以防止乙醇的揮發，影響結果的準確性。

樣品處理選擇提取溶劑時，不僅要考慮浸提溶劑是否與待測組分發生反應、欲分析物質在溶劑中溶解性，還要考慮到溶劑的毒性[10]。傳統方法亞鐵氰化鉀溶液在使用過程中受熱分解產生氰化物有劇毒而無水乙醇沒有毒性。另外，作為一種有機溶劑，苯甲酸、山梨酸、糖精鈉均易溶于無水乙醇。故綜合沉淀的時間、濾液的澄清度、提取溶劑的毒性及待分析物質溶解性的差異，無水乙醇可以作為質量濃度106 g/L亞鐵氰化鉀－219 g/L乙酸鋅溶液的替代物。

[1]GB/T 5009.28-2003食品中糖精鈉的測定[S].北京：中國標準出版社，2003.

[2]GB/T 5009.29-2003食品中山梨酸、苯甲酸的測定[S].北京：中國標準出版社，2003.

[3]黃雄偉.鹽提法提取黃粉蟲蛋白質工藝研究［J］.食品與機械，2010，26（3）：150-152.

[4]GB/T 5009.33-2003食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定[S].北京：中國標準出版社，2003.

[5]劉賜敏，周金森，劉鈺釵，等.HPLC測定乳制品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉的前處理方法研究[J].中國衛生檢驗雜志，2006，11（16）：1315-1316.

[6]祝偉霞，魏蔚，楊冀州，等.高效液相色譜法測定乳飲料和奶制品中苯甲酸和山梨酸[J].中國國家衛生檢疫雜志，2005，28（5）：280-281.

[7]李白玉，鄭兵福，蔣立文，等.四棱豆蛋白質提取工藝研究[J].食品與機械，2010，26（2）：126-128.

[8]楊潔，夏虹，彭茂民.含乳飲料中山梨酸·苯甲酸·糖精鈉的含量測定前處理方法初探[J].安徽農業科學，2007，35（25）：7729-7730.

[9]朱建豐.HPLC同時測定豆制品中常見的3種食品添加劑[J].食品與機械，2012，28（4）：87-89.

[10]汪輝,曹小彥,李林,等.反相高效液相色譜法對果蔬汁飲料中14種常見食品添加劑的快速測定[J].分析測試學報,2009,28（10）：1194-1197.