乳酸桿菌對感染大腸桿菌小鼠腸黏膜免疫的影響

周晶，周穎，曹鳳波，劉賓，霍貴成

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

0 引言

大腸桿菌典型菌株O157：H7能夠引起溶血性尿毒癥、腹瀉及出血性腸炎等疾病，危害人類健康[1]。腸道粘膜免疫系統是機體防御的重要防線，它能阻止病原微生物與腸上皮細胞的接觸并通過抗原的刺激激發機體相應的免疫應答。病原菌入侵機體后，非特異性免疫系統被激活，病原菌被吞噬細胞識別吞噬，溶酶體將病原菌降解，進而激活T淋巴細胞等具有免疫功能的細胞，促使這些細胞分泌IL-2等細胞因子。細胞因子能夠參與機體免疫應答，調節適應性免疫和固有免疫應答。sIgA是機體腸黏膜免疫系統重要的抗體之一，由sIgA參與的體液免疫是防御病原菌在腸黏膜定植的重要防線[2]。sIgA和細胞因子的質量濃度是研究腸道粘膜免疫反應的重要參考指標[3]。

乳酸桿菌能刺激腸粘膜免疫系統分泌sIgA等抗體及IL-6等細胞因子，對于大腸桿菌引起的腹瀉起到預防和治療的作用[4]。副干酪乳桿菌LAFTI L26能夠促進IL-2等細胞因子的分泌，提高機體的免疫力[5]。本研究以副干酪乳桿菌KLDS1.0351和植物乳桿菌KLDS1.0986為目標益生菌，探究其對免疫的調節作用。

1 實驗

1.1 材料與設備

菌種：副干酪乳桿菌KLDS1.0351，植物乳桿菌KLDS1.0985和 KLDS1.0986。大腸桿菌 O157：H7（Escherichia coli O157：H7 ATCC 43889）。

實驗用小鼠：小鼠購買自哈獸研六周齡，等級為清潔級，體重約在20～25 g的雌性BALB/c小鼠；

試劑盒：小鼠sIgA，白細胞介素（IL-2、IL-6），IFN-γ ELISA試劑盒。

設備：高壓滅菌鍋HVE-50HIRAYAM，恒溫培養箱，Model680型酶標儀，VD-1320潔凈工作臺。

1.2 方法

1.2.1 灌胃液的制備

將穩定期的副干酪乳桿菌、植物乳桿菌及大腸桿菌菌液6 000 rpm離心10 min，收集菌體無菌PBS洗滌兩次，棄去上清液，用PBS懸浮并調節菌濃度至108cfu/mL，4 ℃保存備用[6-7]。

1.2.2 試驗動物分組

試驗將小鼠分為四組（空白組；大腸桿菌對照組；副干酪乳桿菌組；植物乳桿菌組），每天12∶00進行灌胃，灌胃體積為0.2 mL[8]。實驗動物分組如表1所示。分別在第1，3，5，7，9，11，13，15 d 9∶00（提前進食）處死4組小鼠，每組3只，解剖取小腸組織。

表1 動物試驗設計

1.2.3 小鼠外觀及生長狀況觀察

試驗期間觀察小鼠的進食、毛色、精神狀態、體重及糞便變化。

1.2.4 sIgA的測定

縱向剖開小腸，5 mL無菌的PBS沖洗小腸內容物，在4℃、10 000×g條件下離心10 min,收集上清液分裝于離心管中，在-20℃下儲存，待樣品收集完后用sIgA ELISA試劑盒進行測定[9-10]。

1.2.5 細胞因子的測定

將小腸稱重后按PBS∶小腸=9∶1的比例加入無菌PBS，用組織勻漿器將小腸破碎后倒入離心管中，在4℃（8 000 r/min）條件下離心10 min收集上清液并分裝于離心管中，-20℃下儲存，待樣品收集完后用細胞因子ELISA試劑盒進行測定[11-12]。

1.2.6 數據處理

試驗數據根據SPSS19.0統計軟件和Excel進行相關性及方差分析并繪制圖標，以0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與討論

2.1 灌胃期間小鼠外觀及體質量的變化

在灌胃期間觀察小鼠的外觀及體重變化。當小鼠的食欲降低、出現腹瀉及毛色變得不柔順沒有光澤甚至出現掉毛現象時說明小鼠感染大腸桿菌模型建立成功。試驗第4 d小鼠出現腹瀉癥狀，精神萎靡，進食量減少，出現脫毛現象，說明大腸桿菌感染模型建立成功。從第8d補充兩株乳酸桿菌后，小鼠的精神狀態逐漸好轉，進食量增加，腹瀉癥狀逐漸緩解。灌胃期間小鼠體質量的變化如圖1所示。

圖1 兩株乳酸桿菌對感染大腸桿菌O157：H7小鼠體質量的影響

由圖1可以看出，在1～14 d的灌胃中空白組小鼠的體質量相對穩定，在1～7 d灌胃大腸桿菌的小鼠體質量呈下降的趨勢，從第3天開始，灌胃大腸桿菌的三組小鼠體質量與空白組差異顯著（P＜0.05）。第8天對小鼠補充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌后，從第9 d開始小鼠的體質量有所上升，雖然體重仍低于空白組和致病前的初始體質量，但與未補充大腸桿菌的對照組相比差異顯著（P＜0.05）。在灌胃兩株乳酸桿菌后，小鼠的體質量有所增加，而對照組的小鼠體質量仍繼續下降,這說明該兩株乳酸桿菌對大腸桿菌引起的小鼠體質量減輕的癥狀能夠起到一定的緩解作用；當在灌胃后的第15天對小鼠進行稱量發現兩株乳酸菌組小鼠的體質量之間并沒有顯著性差異，這說明兩株乳酸桿菌對大腸桿菌引起的小鼠體質量減輕的緩解作用水平是相當的。

2.2 兩株菌株對感染小鼠腸黏膜免疫的影響

2.2.1 對小鼠腸黏膜sIgA的影響

sIgA對致病菌在腸道的定植起到抑制作用，能與微生物等抗原結合形成抗原-抗體復合物[13-14],對維持機體腸道健康有著重要意義。小鼠在1～14 d灌胃中sIgA的變化如圖2所示。

圖2 兩株乳酸桿菌對小鼠腸黏膜sIgA質量濃度的影響

由圖2可知，空白組小鼠sIgA的質量濃度相對穩定；小鼠在感染大腸桿菌后sIgA的分泌量開始增加，并在第5 d達到最大值，從第7 d開始sIgA的分泌量減少，第11 d sIgA的質量濃度低于空白組，從第13 d開始與空白組差異顯著（P＜0.05）；第8 d開始對小鼠分別補充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌，從第9 d開始兩株乳酸菌組sIgA的質量濃度上升，并且與空白組及對照組差異顯著（P＜0.05），當在第11 d達到最大值。兩株乳酸菌引起腸粘膜中sIgA的質量濃度增加遠高于大腸桿菌引起sIgA增加的最高水平。

2.2.2 對小鼠腸黏膜IFN-γ的影響

IFN-γ能夠抑制IgE的分泌進而抑制由IgE引起的I型超敏反應[15],IFN-γ還可以激活NK細胞，是機體發揮免疫調節作用的重要細胞因子。小鼠在1～14 d灌胃中IFN-γ的變化如圖3所示。

圖3 兩株乳酸桿菌對小鼠腸黏膜IFN-γ的影響

由圖3可以看出，空白組小鼠IFN-γ的質量分數相對穩定，小鼠感染大腸桿菌后IFN-γ的質量分數增加，在第3 d達到最大值，之后降低，從第7 d開始低于對照組，在第15 d與空白組差異顯著（P＜0.05）；在第8 d補充兩株乳酸桿菌后，IFN-γ的質量分數增加，與空白組和對照組差異顯著（P＜0.05）。其中副干酪乳桿菌在第11 d達到最大值，之后下降，植物乳桿菌在第9 d達到最大值，之后開始下降。兩株乳酸桿菌引起的IFN-γ的增加遠高于小鼠感染大腸桿菌引起的IFN-γ增加的最大值。

2.2.3 對小鼠腸黏膜IL-2的影響

IL-2是由T細胞合成的，能夠降低炎癥作用，對由感染致病菌引起的免疫抑制起到一定的緩解作用[16]。小鼠在1～14 d灌胃中IL-2的變化如圖4所示。

圖4 兩株乳酸桿菌對小鼠腸黏膜IL-2的影響

由圖4可以看出，空白組小鼠IL-2質量分數相對較為穩定；對照組小鼠在灌胃大腸桿菌后IL-2質量分數增加，在第3天達到最大值，之后開始下降，第9天與空白組差異顯著（P＜0.05）；第8天補充兩株乳酸桿菌后，IL-2的質量分數在第9天開始增加，副干酪乳桿菌在第11天達到最大值，植物乳桿菌在第13天達到最大值；兩株乳酸桿菌組IL-2的質量分數均顯著高于空白組和對照組（P＜0.05），在第15天時仍然與對照組和空白組差異顯著（P＜0.05）。

2.2.4 對小鼠腸粘膜IL-6的影響

IL-6能夠參與NK細胞、T淋巴細胞活化，還能夠促進淋巴細胞增殖。小鼠在1～14 d灌胃中IL-6的變化如圖5所示。

圖5 兩株乳酸桿菌對小鼠腸黏膜IL-6的影響

由圖5右以看出，空白組IL-6質量分數較為穩定；灌胃大腸桿菌后，IL-6的質量分數增加并在第5天達到最大值，之后開始下降,從第9天開始小于對照組；在第8天對小鼠補充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌后，IL-6的質量分數明顯增加，并與對照組及空白組差異顯著（P＜0.05）；植物乳桿菌和副干酪乳桿菌分別在第9天和第11天達到最大值，之后雖然有所下降，但均與對照組及空白組差異顯著（P＜0.05），且高于大腸桿菌引起的最大值。

2.3 討論

對感染大腸桿菌的小鼠分別補充副干酪乳桿菌和植物乳桿菌后，小鼠的體質量有所上升，但仍較空白組低，說明乳酸桿菌對大腸桿菌引起的小鼠體重減輕有一定的延時性，如果長期服用效果可能會更好。小鼠在感染大腸桿菌初期sIgA及細胞因子的質量濃度上升，之后下降，這可能是由于大腸桿菌入侵后會刺激機體產生免疫反應，但隨著大腸桿菌的不斷入侵，小鼠腸黏膜免疫遭到破壞，抑制了細胞因子的分泌。補充兩株乳酸桿菌后，sIgA及三種細胞因子的分泌量顯著提高且都遠遠高于大腸桿菌引起的最大分泌量，由此我們猜測細胞因子及sIgA的分泌量是導致大腸桿菌對照組與兩株乳酸桿菌組小鼠機體免疫反應差異的主要原因，乳酸桿菌可以調節腸粘膜中的細胞因子及sIgA的質量濃度進而對免疫機制進行調節，對機體感染大腸桿菌起到治療的作用，這與相關研究也是吻合的[17]。

3 結論

副干酪乳桿菌KLDS1.0351和植物乳桿菌KLDS1.0986能對大腸桿菌感染引起的腹瀉和體重減輕起到緩解的作用，兩株菌株能顯著促進感染大腸桿菌小鼠腸粘膜中IFN-γ，IL-2，IL-6及腸道中sIgA的分泌，并遠遠高于大腸桿菌刺激的最大值。

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