酶解析-HPLC-ICP-MS同時測定生乳及乳粉中砷形態及質量濃度

趙建國，李琴，陶大利，姜金斗

（農業部乳品質量監督檢驗測試中心哈爾濱，150090）

0 引言

砷是一種廣泛分布于自然界的元素。各種不同的砷形態其物理、化學性質、毒性亦各不相同。其中無機砷的毒性最大如As（Ⅲ）和As（Ⅴ）,有機砷的毒性較小如MMA和DMA,而AsB,AsC和砷糖等通常被認為是無毒的[1]。因此,分析砷在食品的形態對評價對人體危害的風險分析具有重要意義。國家對液態乳總砷限量要求為0.1 mg/kg；乳粉為0.5 mg/kg[2]。

砷不同形態分析研究近年來報道較多，主要集中在水產品及環境樣品等[3-14,20-23]，而其他食品[15-16]特別是生乳及乳制品中不同砷形態含量的分析研究方面少有報道[1]。由于通用的原子熒光僅能對樣品中的無機砷或經消化處理后的總砷進行測定[17]。其他測定不同砷形態方法如微波萃取-原子熒光光譜法、離子色譜法也有報道[18-19]，但目前對測定不同砷形態仍以HPLC-ICP-MS方法最多。乳品類樣品基質復雜，本研究重點集中在樣品前處理優化方面：通過酶水解解決了對不同砷形態的吸附問題，通過采用萃取小柱以脫去脂肪。從而實現了對乳品中5種不同砷形態的準確測定。

1 實驗

1.1 試劑

無水乙酸鈉，硝酸鉀，磷酸二氫鈉，氫氧化鈉，無水乙酸鈉，無水乙醇，檸檬酸鈉，冰乙酸，乙二胺四乙酸二鈉，堿性蛋白酶（20萬單位），砷甜菜堿、一甲基砷、二甲基砷、砷酸根、亞砷酸根標準品。

1.2 儀器及材料

Waters 2695高效液相色譜，ICP-MS Elan6000電感耦合等離子體質譜儀；固相萃取裝置；PEP-2SPE小柱，200mg/6mL；高速冷凍離心機。

1.3 樣品處理

1.3.1 酶解析提取砷

稱取生乳樣品40 g（精確至0.1 mg）或乳粉樣品稱取8g（精確到0.1 mg）于錐形瓶中，乳粉用30 mL溫水溶解樣品。用濃度為0.5mol/L的氫氧化鈉溶液調pH=9.5后分別加入0.2 g堿性蛋白酶（20萬活力單位），放入60℃恒溫箱中水解30 min。取出后分別加入質量分數為12%檸檬酸溶液4.0 mL，轉入50 mL容量瓶中定容。4℃冰箱中靜止5 min，將部分樣液轉入離心管中，以8 000 r/min離心10 min，同時做試劑空白實驗。

1.3.2 固相萃取柱脫脂凈化

將PEP-2SPE小柱置于固相萃取裝置上，用5mL甲醇活化，用5mL去離子水過柱并排干，吸取2mL樣液過柱棄掉后，再吸取3mL樣液通過小柱,并接收于試管中，通過0.45 μm濾膜過濾后用于測定。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：陰離子保護柱IonPac AG 19（50 mm×4 mm,11 μm）；陰 離子分析柱IonPac AS 19（250 mm×4mm,7.5 μm）；柱溫 35 ℃ ；流速 1.0mL/min；進樣量50μL；流動相[10 mmol/L無水乙酸鈉+3mmol/L硝酸鉀+2.0 mmol/L磷酸二氫鈉+0.2 mmol/L乙二胺四乙酸鈉，用4.0%NaOH溶液調節pH=10.7]∶無水乙醇為99∶1。

1.4.2 ICP-MS條件

積分時間1 s；功率1 100 W；玻璃同心霧化器；載氣流量1.0L/min；輔助氣流量1.2 L/min；采集質量數74.9216；靈敏度≥260 mg/L；進樣管內徑≤0.2 mm。

1.4.3 標準曲線配制

分別用超純水將5種形態砷質量濃度分別為10.0μg/mL的標準貯備溶液逐級稀釋，配制成質量濃度為 0.0，1.0，2.0，5.0，10.0 ng/mL的標準系列溶液。在優化的實驗條件下,測定系列標準溶液,等離子體色譜軟件計算各色譜峰的積分面積并自動繪制校準曲線。

2 結果與討論

2.1 樣品處理的優化

2.1.1 蛋白質等吸附對不同砷形態測定結果的影響

由于生乳及乳粉中成分復雜，蛋白質及脂肪質量分數較高，基質干擾大。為能達到既能有效降低基質干擾，又能準確測定各組分質量分數的目的，前處理技術尤為重要。由于乳蛋白具有較強的吸附性，對不同砷形態可能具有明顯的吸附作用，若不能從中解析出來就會造成測定結果偏低，達不到準確測定的目的。為此通過加入堿性蛋白酶的方式將蛋白質進行降解后測定收到顯著的效果。

由于樣品中各組分質量濃度甚微，為此采用加入標準樣品的方式以考察蛋白對待測物因吸附而造成的影響。其實驗方法為將生乳在高壓滅菌鍋中滅菌后取出，冷至室溫后在超凈工作臺中分別稱取40 g樣品置于150 mL錐形瓶中，分四組，每組4個樣品。每組中3個樣品分別加入各含有0.250 μg砷不同形態的標準樣品，1個樣品作為空白。先取其中兩組其中一組加入堿性蛋白酶、一組不加入堿性蛋白酶直接按1.3樣品處理方法進行處理后測定其質量濃度；另兩組密閉后在無菌狀態室溫下放置2周，按上法進行處理后分別測定其質量濃度，以考察各組分變化情況。通過測定，所有未加入標準品的樣品各組分均未檢出，在表1中就不再一一列出，結果如表1所示。

由表1可以看出，加入標準砷樣品后直接測定兩組處理，不同砷形態回收率測定結果加酶處理稍高于未酶處理，但無變化顯著差異。而加入標準砷樣品放置兩周后再測定則差異顯著，特別是AsⅢ未加酶回收率僅81.2%，加酶處理達99.2%，說明乳蛋白對不同砷形態各組分都有一定的吸附。采用堿性蛋白酶將乳蛋白降解后可有效釋放出被吸附的砷。

表1 堿性蛋白酶處理前后不同砷形態測定結果（n=3）

2.1.1 PEP固相萃取小柱處理后對測定結果的影響

由于生乳及乳粉中含有較高的脂肪，根據該色譜柱的特性，若大量的脂肪進入陰離子分析柱，將會使脂肪吸附于色譜柱內很難被洗脫，從而即影響色譜柱的分離，同時又可使色譜柱壽命大大縮短。另外若脂肪被導入等離子焰炬中會造成錐管等處積碳，從而使靈敏度降低，基質干擾增大，為此必需先將樣品中脂肪去除。脂肪去除方式可采用有機溶劑如正己烷等去除，也可采用固相萃取小柱。本研究采用固相萃取小柱去除脂肪效果較好，且操作簡便，同時避免了因大量使用有機溶劑而對人體產生的危害。

2.2 方法線性范圍與檢出限

按照1.4分析方法,分別對5種形態砷標準溶液進行測定，在系列濃度范圍內呈良好的線性關系（見圖1和表1）。采用生乳樣品按照1.3樣品處理方法處理后對各組分進行了最低檢出限的測定，并以本底3倍噪音分別計算樣品最低檢出限，結果如表2。

圖1 5種不同砷形態標準曲線

由表2可知，5種形態砷標準曲線線性較好，相關系數（r）在0.9996～0.9999間；最低檢出限在0.5～1.6 μg/kg間。完全可以滿足國家限量標準乳中總砷為0.1 mg/kg規定測定的要求。

2.3 方法的回收率和精密度

分別選取嬰兒配方奶粉與生乳添加五種形態砷標準溶液后按1.3進行樣品處理，測定回收率；分別稱取6份嬰兒配方奶粉與生乳樣品后再分別添加0.250 μg混合標準溶液，處理液分別進樣測定精密度，未添加標準溶液的兩樣品測定值均為小于檢出限。經測定，兩樣品各組分不同添加量回收率平均值AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV分別為99.4%，92.7%，101.1%，91.8%，92.0%，兩個樣品RSD平均值分別為4.54%，4.39%，5.58%，4.92%，4.68%。回收率與精密度測定結果如表3和表4所示。

表2 5種形態砷分線性回歸方程與最低檢出限

3 樣品分析

選取乳粉、生鮮奶各3種,按所建立的HPLC-ICP-MS的分析方法檢測5種形態砷含量,以驗證實際應用的可靠性。結果參見表5。圖2為奶粉樣品與標準溶液中5種形態砷的色譜圖。結果表明,所檢測樣品中只檢測出了AsⅢ和AsV，其含量極低，遠低于國家限量標準,故樣品中無機砷的指標是安全的。

圖2 標準溶液及奶粉樣品提取液色譜

4 結論

（1）本研究建立了生乳與乳制品中5中形態砷的液相色譜-電感耦合等離子質譜測定方法。該法具有樣品處理簡單、測定周期短、靈敏度高等優點。

（2）通過對樣品前處理方法的優化。通過在樣品中加入砷標準混合溶液，放置2周后采用堿性蛋白酶水解前后的比較，發現水解乳蛋白后可將吸附態的砷解析。酶水解液再加入3%檸檬酸可進一步去除雜質，從而大大減小了基質干擾。樣液再通過PEP固相萃取小柱處理則可有效去除樣液中的脂肪，使色譜柱的分離度顯著提高、色譜柱的壽命延長。通過上述對樣品的處理，從而實現了準確測定乳品中5種形態砷質量分數，大大提高了檢測靈敏度；AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV 最低檢出限分別達到 0.56，0.54，1.56，1.56，0.84 μg/kg，滿足了對痕量成分測定的要求。

（3）該方法砷質量濃度在0～10 ng/mL的范圍內呈良好的線性關系。5種形態砷其相關系數（r）全部在0.999以上。

（4）AsB，DMA，AsⅢ，MMA，AsV的加標回收率平均值分別為99.4%，92.7%，101.1%，91.8%，92.0%；RSD平均值分別為4.54%，4.39%，5.58%，4.92%，4.68%。完全能滿足微量成分定量測定的要求。

表3 樣品中5種形態砷回收率測定結果

表4 樣品5種形態砷精密度測定結果

表5 生乳與乳粉中5種形態砷測定結果（n=3） μg·kg-1

（5）通過對生乳及乳粉樣品的測定，只檢出了AsⅢ和AsV，其質量分數遠低于國家限量標準[2]要求。

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