乳桿菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)對酵母細胞膜通透性的影響

陳忠軍，李海瑄，高鶴塵

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，呼和浩特010018）

0 引言

酵母菌應用很早，在釀酒、食品、醫(yī)藥工業(yè)等方面占有重要地位。某些酵母菌可引起人和植物的病害[1]。故在食品工業(yè)中，防腐保鮮極為重要。近年來人們越來越重視天然安全、適用性廣且性能穩(wěn)定的生物防腐劑[2]。

生物防腐保鮮技術(shù)就是利用有益微生物作為保護菌株，以殺死或抑制腐敗菌和致病菌，延長食品貯藏期，提高安全性。乳桿菌是公認的安全生物，即能改善食品風味，且對其它細菌存在天然的排斥性[3]。

乳桿菌不僅能抑制多種細菌的生長，也能產(chǎn)生抗真菌化合物，對真菌起到抑制作用[4-6]。目前對具抑細菌活性的乳桿菌的研究工作已經(jīng)有很大進展，但對于具抑真菌能力乳桿菌的研究還較新，且對抑酵母菌活性物質(zhì)抑菌作用機理的研究甚少。

因此，對從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選出的具有抑酵母菌作用的乳桿菌進行深入研究，揭示其抑菌作用機理具有重大的理論意義，在開發(fā)天然食品防腐劑及其利用方面具有廣闊的前景。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌株

實驗菌：ALAC-3、ALAC-4，從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到，為乳桿菌屬。

指示菌：白假絲酵母（Candida albicans），中國微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

乳桿菌培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基；指示菌培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基；抑菌活性檢測培養(yǎng)基：水瓊脂培養(yǎng)，TSB培養(yǎng)基配制方法見參考文獻[7-8]。

1.1.3 試劑

牛肉膏，大豆蛋白胨，胰蛋白胨，酵母提取粉，葡萄糖，吐溫80，檸檬酸銨，乙酸鈉，磷酸氫二鉀，硫酸鎂，硫酸錳，磷酸二氫鉀，氯化鈉，檸檬酸氫二銨，Agar，硫酸銨（分析純），磷酸緩沖液，牛血清蛋白，Trizma base，考馬斯亮藍G-250等。

1.1.4 儀器

FLC-3型超凈工作臺，HVE-50型全自動高壓滅菌鍋，SPX-1500型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，BCD-245D型冰箱，12001型上皿電子天平，HM-12型pH計，萬用電熱器，L600型低速自動平衡離心機，RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，游標卡尺（精密度0.02 mm），DDBJ-350型便攜式電導率儀，T6新世紀紫外可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化及抑菌物濃縮液的制備

將半固體穿刺保存的乳桿菌菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中活化一代（37℃，16～24 h），將第一代發(fā)酵液離心（3 000 r/min，10 min），取上清液。再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對上清液進行濃縮至25倍，得到濃縮液。

1.2.2 抑菌物質(zhì)的粗提

（1）飽和硫酸銨溶液的制備。取分析純NH4）2SO4800 g，加蒸餾水1 000 mL，不斷攪拌下加熱至50～60℃，并保持數(shù)分鐘，趁熱過濾，濾液在室溫中過夜，有結(jié)晶析出，即達到100%飽和度，用濃氨水調(diào)pH值為7.0，備用。

（2）硫酸銨飽和度的確定。向抑菌物濃縮液中加入一定量的飽和硫酸銨溶液以達到所需硫酸銨飽和度，飽和溶液添加量計算如式（1）[9]。使硫酸銨的終飽和度為30%，40%，50%，60%，70%，80%，于4℃冰箱放置過夜，第二天冷凍離心（4℃，8 000 r/min，20 min），收集沉淀用pH值為6.0濃度0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解，將指示菌接種到無菌生理鹽水中，調(diào)至濃度為105mL-1，并充分混勻，得到供試菌懸液。采用牛津打孔平板法進行活性檢測，根據(jù)抑菌透明圈直徑的大小，確定應采用的硫酸銨飽和度。此飽和度下的上清液中殘存的抑菌活性物質(zhì)幾乎被完全沉淀[10]。

式中：V0為蛋白質(zhì)溶液的原始體積；C2為所要達到硫酸銨飽和度；C1為原來溶液的硫酸銨飽和度；V為應加入飽和硫酸銨溶液的體積。

（3）抑菌物質(zhì)粗提液的制備。根據(jù)確定的硫酸銨飽和度，在濃縮液中加入適量的飽和硫酸銨溶液，放入4℃冰箱中放置過夜，取出后高速離心（8 000 r/min，20 min），棄去上清液可得含蛋白質(zhì)沉淀粗提物。用無菌水配置成不同質(zhì)量濃度的粗提液，質(zhì)量濃度分別為0.04，0.4，0.5，4 g/mL，放入-20 ℃冰箱中備用。

1.2.3 指示菌菌懸液的制備

將酵母菌從斜面保存中接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中活化一代（30 ℃，36～48 h），取200 μL酵母菌液至150 mL滅菌的生理鹽水中，并用混勻器混勻，得到供試菌懸液，使菌懸液濃度為105mL-1。

1.2.4 菌液電導率的測定

取10 mL酵母菌菌懸液，分別加入200 μL不同濃度抑菌物質(zhì)粗提液，測定其一定時間內(nèi)的電導率。以不加抑菌物質(zhì)粗提液為空白對照。

1.2.5 菌液中可溶性蛋白的測定

（1）牛血清蛋白濃度——吸光度標準曲線的繪制。以牛血清蛋白（BSA）作為標準蛋白，稱取10 mg的BSA溶于少量去離子水中，定容到10 mL，成為質(zhì)量濃度為10 g/L原液。分別取原液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于不同試管中，再分別加入1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL去離子水，使總體積為1.0 mL。分別加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250反應液于各試管中，震蕩搖勻，放置2 min后使用紫外可見分光光度計，1 cm的石英比色杯，在595 nm處測定吸光值，以去離子水加反應液為空白對照。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，重復三次[11]。

（2）供試菌蛋白質(zhì)提取。在酵母菌菌懸液中加入抑菌物質(zhì)粗提液，分別處理2、6、10、24 h后取出1 mL，之后分別加入5倍體積的Tris-HCl緩沖液。以不加抑菌物質(zhì)粗提液為空白對照。

（3）樣品蛋白質(zhì)的測定。準確吸取0.1 mL各處理樣品于10 mL的具塞試管中，加入5 mL考馬斯亮藍G-250染色劑，混合均勻后放置2 min，用10 mm厚的比色杯在波長595 nm處測定光度值，從標準曲線中查的相應的蛋白質(zhì)含量[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨飽和度的確定

不同蛋白質(zhì)粗提所使用的最佳硫酸銨飽和度不同。按照1.2.2.2的方法對菌株ALAC-3、菌株ALAC-4的抑菌物質(zhì)進行粗提，分別用上清液和沉淀溶液作抑菌實驗，結(jié)果如表1和表2所示。

表1 ALAC-3硫酸銨飽和度的確定

表2 ALAC-4硫酸銨飽和度的確定

由表1和表2可以看出，菌株ALAC-3和菌株ALAC-4均在硫酸銨飽和度為40%時，大部分活性物質(zhì)被沉淀下來，使得此飽和度下的抑菌圈直徑達到最大值。因此，兩種菌株抑菌物質(zhì)粗提的硫酸銨最佳飽和度均為40%。

2.2 抑菌物質(zhì)對酵母菌液電導率的影響

細胞膜是細菌的保護屏障，當細菌遇到強抑菌劑而使細胞膜遭到破壞時，菌體的保護屏障被打破，使其內(nèi)部電解質(zhì)外泄至培養(yǎng)液中，進而使培養(yǎng)液的電導率上升。因此，菌液電導率的變化反映了細菌細胞膜通透性的變化[13]。

按照1.2.5的方法將兩種菌抑菌物質(zhì)粗提液分別與酵母菌菌懸液混合處理不同時間后，測定其電導率，結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 ALAC-3不同質(zhì)量濃度粗提液對酵母菌菌懸液電導率的影響

圖2 ALAC-4不同質(zhì)量濃度粗提液對酵母菌菌懸液電導率的影響

由圖1和圖2可以看出，粗提液質(zhì)量濃度為0.04 g/mL時處理酵母菌懸液，其電導率均低于對照。其原因可能是在上述條件下，抑菌物質(zhì)并沒有破壞細胞膜，而是與細胞膜外表面發(fā)生了靜電結(jié)合，導致帶電離子減少，使培養(yǎng)液的電導率降低；隨著質(zhì)量濃度的增大，電導率也隨之增大，說明質(zhì)量濃度越高對細胞膜的破壞越大。

對于菌株ALAC-3，在抑菌物質(zhì)粗提液質(zhì)量濃度為4 g/mL處理酵母菌懸液，菌液電導率明顯增大；而菌株ALAC-4在粗提液質(zhì)量濃度為0.5 g/mL時，酵母菌液電導率就發(fā)生明顯增大，說明這兩株菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對酵母菌細胞膜通透性的影響不同，菌株ALAC-4對于酵母細胞膜通透性的破壞明顯強于菌株ALAC-3。

在4 g/mL質(zhì)量濃度下，1 min時兩株菌的電導率均顯著上升，之后趨于穩(wěn)定，說明抑菌物質(zhì)在1 min時就發(fā)揮了作用，使指示菌胞內(nèi)的離子滲出，從而達到抑菌的目的。

2.3 抑菌物質(zhì)對菌液中可溶性蛋白的影響

2.3.1 牛血清蛋白標準曲線

按照1.2.5（1）的方法繪制牛血清蛋白標準曲線，結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)圖3，可得其線性回歸方程為y=0.1475x+0.0395，其中R2=0.9954（＞0.99）。

2.3.2 抑菌物質(zhì)對菌液中可溶性蛋白的影響

圖3 牛血清蛋白標準曲線

按照1.2.5（2）和1.2.5（3）的方法將兩種菌抑菌物質(zhì)粗提液分別與酵母菌菌懸液混合處理不同時間后，測定其吸光度。根據(jù)所得標準曲線得出可溶性蛋白質(zhì)量濃度，結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4 ALAC-3不同質(zhì)量濃度粗提液對酵母菌菌懸液中可溶性蛋白的影響

圖5 ALAC-4不同質(zhì)量濃度粗提液對酵母菌菌懸液中可溶性蛋白的影響

由圖4和圖5可以看出，經(jīng)各質(zhì)量濃度粗提液處理2 h時可溶性蛋白質(zhì)量濃度均大于對照，表明抑菌物質(zhì)可以改變酵母菌細胞膜的通透性，致使蛋白質(zhì)滲漏到膜外；隨著質(zhì)量濃度的增大，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度也隨之增大，說明質(zhì)量濃度越高對細胞膜的破壞越大。

菌株ALAC-3在質(zhì)量濃度為4 g/mL時，可溶性蛋白明顯增大；而菌株ALAC-4在質(zhì)量濃度為0.4 g/mL時，可溶性蛋白就發(fā)生明顯增大，說明這兩株菌所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對酵母菌細胞膜通透性的影響不同，菌株ALAC-4對于酵母細胞膜通透性的破壞明顯強于菌株ALAC-3，這一結(jié)論與上述測得電導率的結(jié)論一致。

2～6 h時可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度有較大幅度的減小，隨后可溶性蛋白質(zhì)量濃度有所增加但增幅不大，表明抑菌物質(zhì)處理對酵母菌產(chǎn)生影響，可能抑制其蛋白質(zhì)合成的速率。

隨著反應時間的延長，抑菌物質(zhì)的有效抑菌成分受到破壞，可溶性蛋白質(zhì)量濃度有所升高，之后液體中本身含有的蛋白質(zhì)被指示菌生命活動所消耗，在處理10 h后可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度達到平衡或有所降低。

3 結(jié)論

試驗可知兩株乳桿菌產(chǎn)生的抑酵母活性物質(zhì)粗提的硫酸銨最佳飽和度均為40%，在此飽和度下，抑菌效果最好。

加入抑菌物粗提液處理酵母菌懸液一定時間后，菌液電導率明顯增加，說明抑菌物能改變細胞膜通透性，使菌體內(nèi)電解質(zhì)滲漏。且可溶性蛋白質(zhì)量濃度均高于對照，說明抑菌物質(zhì)可以改變酵母菌細胞膜的通透性，致使蛋白質(zhì)滲漏到膜外。菌液電導率和可溶性蛋白的測定結(jié)果均表明抑菌物質(zhì)對酵母菌細胞膜通透性有影響，但可說明其影響程度，既可以使電解質(zhì)滲漏，也可以使大分子的蛋白質(zhì)滲漏。

當菌株ALAC-3抑菌物質(zhì)粗提液質(zhì)量濃度為4 g/mL時，菌液電導率和可溶性蛋白明顯增大，而當菌株ALAC-4抑菌物質(zhì)粗提液質(zhì)量濃度分別為0.5 g/mL和0.4 g/mL時，菌液電導率和可溶性蛋白就明顯增大。由此可以得出菌株ALAC-4產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對于酵母細胞膜通透性影響較強。

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