響應面法優化植物乳桿菌產β-半乳糖苷酶發酵培養基

高曉峰，周穎，李柏良，周晶，霍貴成

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030）

0 引言

β-半乳糖苷酶廣泛來源于植物、動物、微生物中。其中微生物來源的β-半乳糖苷酶具有高活性及高穩定性的優點，因而在工業中得到廣泛應用[1]。該酶通過其水解活性可以克服乳糖不耐癥；通過轉糖基作用生成益生元—低聚半乳糖[2]。

乳酸菌是公認安全（GRAS）的食品級微生物，因此，乳酸菌來源的酶可以不需進行大量的純化而在各種食品工業中應用[3]。目前乳酸菌中嗜酸乳桿菌[4]、保加利亞桿菌[5]、短乳桿菌[6]等β-半乳糖苷酶的研究較多，而對植物乳桿菌β-半乳糖苷酶的研究相對較少。植物乳桿菌具有耐膽鹽，免疫調節等益生功能[7]。本研究采用響應面法對植物乳桿菌產β-半乳糖苷酶的培養基進行優化，以提高β-半乳糖苷酶的產量，為菌株進一步工業化生產奠定理論基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌KLDS1.0628，鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），鄰硝基酚（ONP），其他試劑均為市售國產分析純或化學純。

種子培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，乳糖20 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉0.5 g，磷酸氫二鉀2 g，吐溫-80 1 g，定容至1 000 mL，pH自然，121℃滅菌15 min。發酵培養基 蛋白胨10 g，酵母粉5 g，乳糖20 g，檸檬酸氫二銨2 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，乙酸鈉0.5 g，磷酸氫二鉀2 g，吐溫-80 1 g，定容至1 000 mL，調pH為6.0，121 ℃滅菌15 min

1.2 儀器與設備

GL-21M冷凍離心機，DU800紫外/可見光分光光度計，Delta 320 pH計，DHP-9272型電熱恒溫培養箱，JY96-IIN超聲波細胞粉碎機。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制備

將植物乳桿菌在種子培養基中活化3代，按體積分數為1%的接種量接種于發酵培養基中，37℃靜置培養24 h，以8 000 r/min（10 min）、4 ℃條件離心菌體，去上清，取等體積磷酸鈉緩沖液重懸菌體，以8 000 r/min（10 min）、4℃條件離心菌體，去上清，完成一次菌泥的洗滌；重復洗滌三次，獲得的菌泥在冰水浴中進行超聲波破碎，工作1 s，間歇2 s，破碎時間15 min，將裂解后的菌液于4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3.2 酶活力測定

向試管中加入2.5 mL，pH值為7.0濃度為50 mmol/L的磷酸氫二鈉/磷酸二氫鈉緩沖液，加入100 μL質量濃度為4 mg/mL（ONPG）溶液和100 μL酶液，40℃恒溫反應10 min后加入0.3 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3溶液中止反應，于420 nm下測定吸光度。采用國際酶活單位：1 mL酶液1 min催化鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）水解生成1 μmol鄰硝基酚（ONP）定義為一個酶活單位。用己知濃度ONP溶液做標準曲線，根據ONP的濃度c對應的OD值，利用最小二乘法建回歸方程：OD=4.4984c-0.0045 R2=0.9996。酶活計算公式為

式中：V1為反應混合液總體積（mL）；4.50為在實驗條件下1 μmol/mL的ONP吸光度；t為反應時間（min）；V2為酶液體積（mL）；n為稀釋倍數。

1.3.3 不同碳源對植物乳桿菌產β-半乳糖苷酶活力的影響

以發酵培養基為對照，選擇葡萄糖、葡萄糖與乳糖質量比1：1的混合糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖替代發酵培養基中的乳糖，質量分數都為2%，調初始pH值為6.0。按1%接種量接種種子液于發酵培養基中，培養溫度37℃，置于恒溫箱內靜置培養24 h，測定β-半乳糖苷酶酶活力。

1.3.4 不同氮源對植物乳桿菌產β-半乳糖苷酶活力的影響

以發酵培養基為對照，選擇蛋白胨、酵母粉、酪蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨替代發酵培養基中的氮源（即蛋白胨、酵母粉），質量分數都為1.5%，調初始pH值為6.0。按1%接種量接種種子液于發酵培養基中，培養溫度37℃，置于恒溫箱內靜置培養24 h，測定β-半乳糖苷酶酶活力。

1.3.5 對植物乳桿菌產酶活力影響

本研究對影響產酶活力的9個因素進行篩選，9個因素包括：乳糖、酵母粉、蛋白胨、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、吐溫-80、硫酸鎂、硫酸錳（均為質量分數）。每個變量分別設定高（+1）和低（-1）兩個水平，實驗因素水平如表1所示。按照Plackett-Burman設計對數據進行分析，得到影響酶活的最主要因素。

1.3.6 最陡爬坡實驗

根據Plackett-Burman試驗結果分析確定主要影響因素，以擬合的回歸方程模型的系數符號和大小來設定主要因素的步長和變化方向，即對主要因素進行質量濃度梯度設計，能快速、經濟地逼近最佳值區域。

表1 Plackett-Burman實驗設計參數與水平

1.3.7 中心組合試驗設計（BBD）

以最坡爬坡設計得出的實驗結果為依據確定Box-Behnken實驗設計的中心點和步長，結果如表2所示。響應值為β-半乳糖苷酶活，主要影響因素為自變量，利用 Design-Expert實驗軟件進行Box-Behnken實驗設計和數據的分析。

表2 BBD實驗因素及水平

2 結果與分析

2.1 不同碳源的影響

圖1 碳源對β-半乳糖苷酶活力的影響

由圖1可以看出，該菌以乳糖為唯一碳源時，β-半乳糖苷酶酶活最高，而當乳糖和葡萄糖共同作為碳源時，酶活明顯降低，說明該菌株生物合成的β-半乳糖苷酶受乳糖操縱子的調控，是誘導酶，與已報道的乳糖對雙歧桿菌[8]和嗜酸乳桿菌[9]影響一致。而Kim和Rajagopal研究發現半乳糖比乳糖對卷曲乳桿菌產β-半乳糖苷酶具有更強的誘導作用[10]，宋園亮等研究發現以葡萄糖作為碳源時，短乳桿菌產β-半乳糖苷酶活性最高[6]。由此可見，不同碳源對產酶的影響因菌株的變化而不同。

2.2 不同氮源的影響

圖2 氮源對β-半乳糖苷酶活力的影響

由圖2可知，該菌采用唯一氮源時，6種氮源中酵母粉效果最好。但其酶活低于以蛋白胨和酵母粉為混合氮源的對照組，此時菌體所產酶的酶活為最大，說明蛋白胨和酵母粉這兩種氮源中的某些成分具有一定的協同作用。因此選取蛋白胨和酵母粉混合氮源作為培養植物乳桿菌KLDS1.0628的氮源。

2.3 重要因素篩選實驗

Plackett-Burman實驗設計及結果如表3所示，實驗的回歸分析如表4所示。

表3 Plackett-Burman實驗設計及結果

表4 Plackett-Burman實驗的回歸分析

由表4可以看出，9種培養基成分對植物乳桿菌產β-半乳糖苷酶影響的顯著性排列為：乳糖＞乙酸鈉＞檸檬酸氫二銨＞吐溫80＞酵母粉＞K2HPO4＞硫酸錳＞蛋白胨＞硫酸鎂。其中，乳糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨影響最為顯著，可作為進一步優化的因素。

2.4 最陡爬坡實驗設計及結果

根據Plackett-Burman試驗結果設計，按一定的梯度改變乳糖、檸檬酸氫二銨和乙酸鈉在發酵培養基中的濃度，檸檬酸氫二銨和乙酸鈉是正效應，應依次增大；乳糖是負效應，應依次減小；其他非主要因素根據表4中的估計系數的正負取Plackett-Burman設計中的最大值或最小值，實驗設計及結果如表5所示。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果

結果表明，隨著乳糖濃度逐漸減小，檸檬酸氫二銨和乙酸鈉濃度逐漸增大，酶活呈現先增大后減小的變化。當乳糖質量濃度為15 g/L，檸檬酸氫二銨為5.0 g/L，乙酸鈉為10 g/L時，酶活達到最大。因此以實驗編號3各因素水平為中心值設計后續響應面實驗。

2.5 Box-Benhnken試驗設計與響應面分析

以β-半乳糖苷酶活力為響應值Y，選取乳糖A、檸檬酸氫二銨B、乙酸鈉C三個因素進行設計，Box-Benhnken試驗設計及結果如表6所示。

表6 響應面試驗設計方案及結果

根據試驗結果，采用逐步回歸的方法進行二次回歸分析，得到相應的回歸方程式為Y=3.28+0.21A+0.20B+0.083C-0.023AB+0.048AC-0.12BC-0.20A2-0.11B2-0.20C2。對回歸模型進行方差分析，結果表明：該方程回歸顯著，模型的R2值為0.9425，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬項為0.0984，大于0.05，因此回歸模型適合，不需對回歸議程調整[11]。

構建β-半乳糖苷酶活與發酵培養組分乳糖、乙酸鈉、檸檬酸氫二銨的三維空間響應面圖，結果如圖3～圖5所示。

表7 回歸模型方差分析

圖3 乳糖與檸檬酸氫二銨對β-半乳糖苷酶活力的影響

圖4 乳糖與乙酸鈉對β-半乳糖苷酶活力的影響

圖5 乙酸鈉與檸檬酸氫二銨對β-半乳糖苷酶活力的影響

圖3～圖5直觀地反映了各因素交互作用對β-半乳糖苷酶的影響。比較三組圖可知，乳糖和乙酸鈉對β-半乳糖苷酶活力的影響比檸檬酸氫二銨對β-半乳糖苷酶活力的影響更為顯著。根據Design-Expert軟件得到的回歸方程可計算得到Y的最大估計值為3.40 U/mL，此時乳糖 16.41 g/L，乙酸鈉 10.21 g/L，檸檬酸氫二銨5.83 g/L。

2.6 驗證實驗

為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化發酵培養基進行驗證實驗，重復3次，測得的酶活平均值為3.32 U/mL，與理論預測值3.40 U/mL基本一致，因此，基于響應曲面法所得的β-半乳糖苷酶發酵培養基參數準確可靠。

3 結論

在發酵培養基的優化試驗中,首先采用單因素試驗對植物乳桿菌KLDS1.0628產β-半乳糖苷酶的最佳碳源、氮源進行優化，得到最佳碳源為乳糖，最佳氮源為蛋白胨和酵母粉。而Duraiswamy Gobinath研究發現半乳糖為碳源時，Lactobacillus plantarum MCC2156產β-半乳糖苷酶活性最高[12]。以乳糖為最佳碳源說明其具有利用工業廢料乳清的潛力，從而降低β-半乳糖苷酶生產成本。通過Plackett-Burman試驗篩選出對酶活影響主要的3個因素即乳糖、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉，然后以最陡爬坡試驗結果為中心點，利用Box-Benhnken試驗設計并進行響應面分析,優化得出植物乳桿菌KLDS1.0628發酵最佳質量濃度分別為：乳糖16.41 g/L，乙酸鈉10.21 g/L，檸檬酸氫二銨5.83 g/L，利用該培養基發酵培養，測得的酶活平均值為3.32 U/mL，與理論預測值3.40 U/mL基本一致，酶活比優化前提高了73.8%。

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