NDRG1與E-cadherin下調表達及其與胃癌淋巴結轉移的關系研究

廖愛輝劉展雷志勝

·論著·

NDRG1與E-cadherin下調表達及其與胃癌淋巴結轉移的關系研究

廖愛輝1劉展2★雷志勝3

目的探討NDRG1和E-cadhein基因mRNA表達與胃癌淋巴結轉移關系。方法收集51例液氮保存的新鮮原發性胃癌組織和33例淋巴結轉移的胃癌，Trizol常規方法提取組織總RNA。在將這些總RNA逆轉錄成cDNA后，利用實時熒光定量PCR檢測NDRG1和E-cadhein基因在這兩種組織中的表達情況，統計分析它們表達變化與胃癌淋巴結轉移的關系。結果與原發性胃癌組織相比，NDRG1與E-cadhein mRNA在淋巴結轉移的胃癌組織中表達下調，且兩者表達明顯呈正相關性。結論降低的NDRG1和E-cadhein基因表達與胃癌的淋巴結轉移密切相關。

NDRG1；E-cadherin；胃癌；熒光定量PCR

胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率居各類腫瘤的前列［1］。該疾病是一種嚴重威脅人類身體健康的疾病，其發病原因不明，可能與多種因素，如飲食種類、環境因素、遺傳素質、以及長期幽

門螺桿菌（helicobacter pylori，HP）感染等有一定的關系。胃正常黏膜在這些因素共同作用下，其細胞內基因表達會發生異常的改變，特別是瘤基因的激活和抑瘤基因的失活，最終會導致腫瘤的發生。

NDRG1是轉錄因子v-myc禽髓細胞瘤病毒癌基因神經母細胞瘤衍生同系物（v-myc avian myelocytomatosis viral oncogene neuroblastoma derived homolog，N-MYC）的下游調節基因，在腫瘤中主要受其抑制而下調表達。NDRG1在多種腫瘤組織中表達明顯減低。最近，Jiang發現該基因在胃癌中表達也明顯下調［2］，提示NDRG1參與了胃癌的發病過程。E-Cadherin是一個上皮間充質轉化標志基因，其在腫瘤侵襲轉移過程中也常常發生表達下調，包括胃癌［3－5］。在以往的研究中，雖有報道顯示這兩個基因與胃癌轉移有一定的關系，但很少有使用原發性胃癌組織以及淋巴結轉移胃癌組織探討這兩個基因在胃癌中轉移的作用，且鮮有研究報道兩者在胃癌淋巴結轉移過程中的表達相關性。

1 材料與方法

1.1 組織標本

51例原發性胃癌組織和33淋巴結轉移性胃癌來自于中南大學湘雅二醫院2012年3月到2013年5月收集的液氮保存標本。該組病人年齡在31到76歲之間，中位年齡52.2歲。其病理類型都為腺癌。

1.2 主要試劑

逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司，Trizol購自美國Invitrogen公司。

1.3 引物設計

在線Primer-blast工具設計NDRG1和E-cadherin基因熒光定量PCR引物，NDRG1上游引物：5′-GTTCTGGAGGTCGGGAAGGG-3′，NDRG1下游引物：5′-CCAAAGGCTTCACCTCAGCG-3′，全長201 bp。E-cadherin上游引物：5′-AAGAGAGTG GAAGTGTCCGA-3′，E-cadherin下游引物：5′-GAT CAGCAGAAGTGTCCCTG-3′，全長282 bp。內參照引物為Beta Actin，上游引物：5′-CACCCAGCACAATGAAGAT-3′，下游引物：5′-CAAATAAAGC CATGCCAAT-3′，全長255 bp。引物由上海英駿公司合成。

1.4 RNA提取及逆轉錄

常規Trizol提取總RNA，總RNA隨即被逆轉錄成cDNA，反應條件如下：總RNA 1μg，2μL dNTPm ix（10mmol／L），2μL oligo（dT）18（0.5μg／μL），添加無RNA酶的去離子水13.5μL，混勻，離心。70℃變性5m in，室溫靜置2m in。然后依次添加4μL 5×Buffer，1μL 0.1 M DTT，0.5μL RNase inhibitor（40 U／μL），1μL逆轉錄酶（200 U／μL），混勻，離心，放入42℃水浴中反應1h，95℃滅活5m in。－20℃冷凍備用。

1.5 表達檢測

應用實時熒光定量PCR在胃癌組織中擴增NDRG1和E-cadherin基因，反應體系為SYBR Prem ix Ex（2×）10μL，上下游引物（10μmol）各0.4 μL、ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4μL、cDNA模板1μL和滅菌去離子水7.8μL，共20μL。反應條件如下：94℃變性2m in；94℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，45個循環；最后，產物在72℃延伸5min，溶解曲線分析。實驗重復3次。

1.6 實驗數據處理及分析

采用SPSS 11.5統計分析軟件包進行數據處理。在本研究中，我們基于目的基因和看家基因實時熒光定量擴增曲線得到Ct（C：循環周期，Cycle；t：閾值，threshold）值，通過ΔCT＝Ct目的基因-Ct內參基因公式，計算出目的基因相對于看家基因的表達強度。ΔΔCt＝ΔCt（腫瘤樣品）-ΔCt（正常樣品）。目的基因相對腫瘤為2-ΔΔCt，當＞1的時候，目的基因表達上調，反則下調。基因表達相關系分析采用Bivariate程序進行分析。

2 結果

2.1 RNA提取

對樣品總RNA行260／280的比值檢測，樣品基本上都在1.7～2.1之間，這表明這些提取的總RNA質量基本合格，可用于下一步實驗（見圖1）。

2.2 NDRG1在淋巴結轉移胃癌中表達降低

我們利用實時熒光定量PCR檢測了NDRG1在原發性胃癌組織與淋巴結轉移的胃癌組織中表達（圖2）。結果顯示，與原發性胃癌組織相比，NDRG1在淋巴結轉移的胃癌組織中表達明顯下調（P＝0.0097）（圖3）。

圖1 1％瓊脂糖凝膠RNA電泳圖Figure 1 1％agarose gel electrophoresismap of RNA

圖2 NDRG1實時熒光定量PCR檢測圖Figure 2 The exam ination map of real-time quantitative PCR of NDRG1

圖3 NDRG1基因在原發性胃癌組織和淋巴結轉移胃癌組織中差異表達Figure 3 Differential expression of NDRG1 between primary gastric samples and gastric cancer tissues of lymphonode metastasis

2.3 E-cadherin在淋巴結轉移胃癌中表達降低

我們利用實時熒光定量PCR檢測了E-cadherin在原發性胃癌組織與淋巴結轉移的胃癌組織中表達（圖4）。結果顯示，與原發性胃癌組織相比，E-cadherin在淋巴結轉移的胃癌組織中表達明顯下調（P＝0.014）（圖5）。

圖4 E-cadherin實時熒光定量PCR檢測圖Figure 4 The examination map of real-time quantitative PCR of E-cadherin

圖5 E-cadherin基因在原發性胃癌組織和淋巴結轉移胃癌組織中差異表達Figure 5 Differential expression of E-cadherin between primary gastric samples and gastric cancer tissues of lymphonodemetastasis

2.4 NDRG1與E-cadherin淋巴結轉移胃癌組織中呈表達正相關性

為了進一步明確NDRG1與E-cadherin基因在淋巴結轉移胃癌組織中表達降低可能存在協同作用，我們利用SPSS軟件Bivariate程序分析了2

個基因在淋巴結轉移的胃癌組織中表達相關性。結果顯示，其表達相關系數r＝0.857，P＜0.001，這表明了NDRG1與E-cadherin表達呈正相關性（圖5），提示了它們在胃癌轉移過程中發揮了協同作用。

圖6 NDRG1在淋巴結轉移胃癌組織中與E-cadherin表達相關性分析Figure 6 The expression correlation analysis of NDRG1 w ith E-cadherin in gastric cancer tissues of lymphonode metastasis

3 討論

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在消化系腫瘤發病中位居第一，其發病年齡多在40歲以上，男性多于女性［1］。胃癌的發病與其基因調節紊亂密切相關［6］。

NDRG1基因定位于人染色體8q24.3，長約60 kb，其mRNA全長約3 kb，編碼蛋白產物含有394個氨基酸，分子質量為43 kd。NDRG1最初是在NMYC敲除的小鼠胚胎組織中發現的，它受NMYC的抑制而得名。該基因被多個學者通過差異顯示法相繼獨立發現和分離［7］。最近的研究顯示，該基因在前列腺癌［8］、胃癌［2］和結腸癌［9］中表達下調。將NDRG1 cDNA導入轉移性結腸癌細胞系SW 620中，觀察到原先高轉移性的結腸癌細胞系SW 620體外侵襲能力明顯下降；將其種植到裸鼠體內，肝臟轉移能力也明顯降低，這提示NDRG1基因參與了結腸癌的轉移過程［10］。

E-cadherin基因定位于16q22.1染色體上，是一種鈣依賴性細胞粘附分子，存在于正常上皮細胞中以維持組織正常形態，這對于保持細胞完整性，防止腫瘤細胞離散、脫落起著很重要的作用。E-cadherin基因作為細胞上皮向間質轉化關鍵基因，其表達降低提示腫瘤細胞開始發生轉移［11］。在以往研究中，已有不少報導顯示E-cadherin在胃癌組織中表達下調促進了胃癌發病過程［12－13］，但這些研究基本上都是基于原發性胃癌標本進行研究。

有意思的是，在最新的研究中已經發現，在口腔鱗狀細胞癌、過表達的NDRG1基因前列腺癌以及大腸細胞中能通過抑制β-catenin上調E-cad herin表達，從而抑制腫瘤發病侵襲和轉移［14－15］。而在口腔鱗狀細胞癌中，NDRG1也能正向調節E-cadherin，從而抑制腫瘤細胞的轉移［16］。以上這些研究提示，NDRG1和E-cadherin在腫瘤發病過程中發揮了協同作用，從而抑制發病過程中。

在本次研究中，為了明確NDRG1與E-cadherin是否參與了胃癌轉移，我們首先利用實時熒光定量PCR對這兩個基因在原發性胃癌與淋巴結轉移的胃癌組織中的表達進行了檢測。結果顯示，與原發性胃癌組織相比，NDRG1與E-cadherin在淋巴結轉移的胃癌組織中表達都明顯下調，提示它們與胃癌淋巴結轉移密切相關。進一步，為了明確NDRG1與E-cadherin是否協同參與了胃癌淋巴結轉移，我們分析了NDRG1與E-cadherin在淋巴結轉移的胃癌組織表達相關性。與預期相符，NDRG1 mRNA是明顯正向相關于E-cadherin mRNA的表達，該結果類似于Chang等研究報告［17］。他們發現，在胃癌轉移過程中，下調的NDRG1蛋白表達與E-cadherin蛋白表達呈正向相關。我們的研究進一步支持NDRG1和E-Cadherin在胃癌中丟失的表達與胃癌轉移密切相關，只是具體的調控機理還有待進一步研究。

綜上所述，NDRG1和E-cadherin作為胃癌轉移的標志物，在胃癌淋巴結轉移組織中表達呈正相關性，且它們下調的表達與胃癌淋巴結轉移密切相關。

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The relationship study between the down expression of NDRG1 and E-cadherin w ith lym phonode metastasis in gastric cancer

LIAO Aihui1，LIU Zhan2★，LEIZhisheng3
（1.The First Surgical Department，the Geology and M ineral Hospital of Hunan Province，Changsha，Hunan，China，410000；2.Medical Department of Digestion，People’s Hospital of Hunan Province，Changsha，Hunan，China，410000；3.General Surgical Department，the Center Hospital of Changsha City，Changsha，Hunan，China，410000）

Objective To explore the relationship between the down expression of NDRG1 and E-cadherin mRNA w ith the lymphonode metastasis in gastric cancer.Methods Total RNAs of 51 primary fresh gastric samples and 33 gastric cancer samples spreading to lymphonode were extracted by routine Trizol way.Then total RNAs were transcripted into cDNAs，and the expressions of NDRG1 and E-cadherin gene were detected by real-time quantitative PCR.Finally，the correlation of NDRG1 and E-cadherin expression in gastric cancer tissues of lymphonodemetastasiswas analyzed.Results Compared w ith primary gastric samples，the expressions of NDRG1 and E-cadherin weremarkedly reduced in gastric cancer tissues of lymphonodemetastasis.Furthermore，the positive correlation of expression between NDRG1 and E-cadherin was also observed.Conclusion Reduced expressions of NDRG1 and E-cadherin were closely associated w ith the lymphonodemetastasis of gastric cancer.

NDRG1；E-cadherin；Gastric cancer；Real-time PCR

湖南省發改委科研項目（2014-2）

1.湖南省地礦醫院外一科，湖南，長沙410000 2.湖南省人民醫院消化內科，湖南，長沙410000 3.長沙市中心醫院普外科，湖南，長沙410000

★通訊作者：劉展，E-mail：Liuzhan2004＠126.com