酒石酸鉀鈉雙水相體系分離純化C-藻藍蛋白

趙 麗 , 彭一良, 康 天, 蔡偉民

(1. 哈爾濱工業大學 市政環境工程學院, 黑龍江 哈爾濱 150080； 2. 哈爾濱師范大學 生命科學與技術學院,黑龍江 哈爾濱 150025)

雙水相(Aqueous two-phase systems, ATPS)是一種新型的分離純化技術[1]。體系中的兩相都是水溶液,操作條件溫和[2], 系統的含水量高達 75%～90%, 為親水性很強的生物物質提供了適宜的環境, 而且不會引起生物物質的失活和變性。因此, 雙水相技術已廣泛的應用于生物化學、細胞生物學、生物化工等物質分離提純領域[3-4]。但由于傳統雙水相的原料聚乙二醇和葡聚糖成本太高, 目前真正工業化的例子還很少。

藻藍蛋白(C-phycocyanin, C-PC )是一種水溶性藍色熒光蛋白, 廣泛存在于藍藻中。C-PC一般由等摩爾的α 和β亞基聚合構成, 每個α亞基或β亞基含有至少 1個直鏈四吡咯化合物的藻膽素(Phycobilins)發色團[5], 使C-PC呈現鮮亮的藍色, 因此C-PC常作為天然色素應用于食品、添加劑和化妝品領域[6]。此外, 由于C-PC還具有高效的熒光特性,也廣泛應用于醫藥保健領域、化學光敏劑, 以及熒光分析等領域[7]。藻藍蛋白純化工藝復雜、成本高、步驟繁多、回收低, 導致天然藻藍蛋白的市場價格高達50美元/mg[8]。螺旋藻是國內外的一種經濟型藍藻,年產高于2 000 t。螺旋藻的蛋白質含量可達干重的70%以上, 其中, 藻藍蛋白的含量超過 20%[9], 因此,常被作為提取C-PC的首選藍藻。國內、外通常采用新鮮的螺旋藻作為提取原料。近年來, 國內已開始選用干藻粉作為提取C-PC原料。

分離純化藻蛋藍白的主要方法是進行多級色譜柱層析[10-11]。其操作步驟繁多、產量少[12-13], 不適合于工業化生產。近年來, 雙水相萃取分離技術已開始被應用于藻藍蛋白的分離純化。國外學者應用PEG4000/磷酸鉀體系[14], 獲得了藻藍蛋白的高純度。但 PEG4000黏度較高, 分相時間較長, 而且C-PC富集于 PEG4000中, 高黏度增加了PEG去除的難度。國內學者應用PEG2000/硫酸銨雙水相體系獲得藻藍蛋白[15], 但最終純度較低僅達到1.2。

本文采用廉價的PEG1000/酒石酸鉀鈉雙水相體系, 分離純化 C-PC, 有效降低了體系黏度。研究雙水相分離純化規律, 分析分離萃取過程中, 各種條件因素的影響情況及相互作用關系, 從而優化雙水相體系參數。實現高效、低成本、易操作的藻藍蛋白提取, 為藻藍蛋白能夠得到廣泛應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

干螺旋藻藻粉購買于中國海洋大學生命科學學院。

聚乙二醇、磷酸鹽、硫酸銨、酒石酸鉀鈉等(分析純)購買于國藥集團化學試劑有限公司。UV-2102 PC型紫外-可見光分光光度計, 中國上海尤尼克公司； 臺式高速冷凍離心機(TGL-16MI)長沙湘麓離心機有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藻藍蛋白的粗提液

準確稱取6 g干螺旋藻藻粉, 溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液, 混合均勻。采用反復凍融法： -20℃冷凍,室溫融化, 反復凍融6次。10 000 r /min 離心10 min,收集上清液, 4℃保存備用。

1.2.2 雙水相體系

選擇PEG /鹽雙水相體系。其中鹽溶液分別為磷酸鉀, 磷酸鈉, 硫酸銨, 酒石酸鉀鈉。繪制體系相圖,根據相圖計算配比, 選取不同體系組成。將不同配比與粗提液混合均勻, 4℃靜置, 分別記錄上、下相分層情況, 上、下相體積, 取少量待測。

1.2.3 雙水相系統參數

純度[12-14,16-17](P)： 目的蛋白在620 nm處的特征吸光值和總蛋白在280 nm處吸光值的比值。

純化因子(F)： 目的產物提純后的純度與粗提液純度的比值。

分配系數(K)： 目的蛋白在上相和下相濃度的比值。C-PC易富集于上相PEG中。實驗證明它在上相的濃度為0.1 g/L時, 在下相濃度是接近0.0 001 g/L。因此下相C-PC的濃度可忽略。

系線長(TLL)： 雙水相系統的上相和下相的濃度總組成的關系。它通常反應了ATPS系統構成對分離材料的影響效果。

體積比(Vr)： 體系上相和下相的體積比。

1.2.4 多次雙水相

取一定量的上一次 ATPS獲得的 PEG溶液, 按照一定的配比與一定量的同種鹽溶液混合均勻, 4℃靜置, 分別記錄上、下相分層情況, 上、下相體積, 取少量待測。其他參數保持和一次ATPS一致。

1.2.5 分析方法

采用紫外-可見光分光光度計對上相溶液進行全波長掃描, 起始波長260 nm, 終止波長700 nm。記錄不同波長處的吸光值。

采用熒光發射光譜測定C-PC的活性。熒光發射光譜的激發波長為560 nm。掃描范圍由580 nm到770 nm。

數據分析運用ORIGN 8.5, MATLAB R2008a。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻藻粉的細胞學形態

光學顯微鏡下觀察螺旋藻的細胞學形態(10倍)見圖1。可見藻段呈螺旋狀。C-PC粗提液純度為0.42。

圖1 螺旋藻藻粉的細胞學形態Fig. 1 The morphology of the dry spirulina platensis powder

2.2 不同鹽相對C-PC純度的影響

在TLL為27%±1%、Vr為1, PEG分子質量一定的情況下, 比較不同的鹽相(磷酸鈉、磷酸鉀、酒石酸鉀鈉、硫酸銨)對C-PC純度的影響, 結果見圖2。C-PC的等電點為 4.0。硫酸銨、磷酸鈉、磷酸鉀、酒石酸鉀鈉構成的雙水相體系的 pH均超過等電點(pH分別為 4.80、5.85、6.80、8.06)[16], 理論上這四種鹽都適合C-PC的提取。因為鹽相中正負離子的存在, 對體系中分子具有不同的親和力, 并產生電位差, 因此, 選擇最佳的鹽相對 C-PC的提純非常重要。PEG分子質量從1 000到4 000的各雙水相體系中, 酒石酸鉀鈉構成的雙水相體系對C-PC提取效果最好。可能是因為酒石酸鉀鈉可以更好的改變蛋白質的疏水性和相間電位的程度, 從而影響蛋白質解離基團的解離度, 提高了 C-PC在上相 PEG中的富集。所以選擇酒石酸鉀鈉作為鹽相, 進行后續試驗。

圖2 不同鹽相對C-PC純度的影響Fig. 2 The influence of different salts phase on the purity of C-PC

2.3 不同PEG分子質量對C-PC純度的影響

在Vr為1,TLL為21.65% 的PEG /酒石酸鉀鈉雙水相體系中, 比較不同的PEG分子質量(1 000、1 500、2 000、4 000), 對C-PC純度的影響, 以C-PC純度為縱坐標, PEG分子質量為橫坐標, 結果見圖3。PEG 1 000體系提取效果最好。在圖 2中,TLL為27%±1%時, 也得到同樣的結果： PEG 1000體系提取效果最好。PEG分子端具有很多游離的具有一定親水性的羥基。在PEG相組成一定時, PEG分子質量的增加, 分子鏈長增加, 雙水相體系中游離羥基的數量減少, 分子內極性基團的比重相對降低, 極性減小, 從而富含PEG的上相的親水性減小。C-PC是一種高親水性蛋白, 低分子質量的 PEG有利于親水性的C-PC到達富含PEG的上相。此外, PEG分子質量的減小, 會使體系黏度降低, 空間阻力減小, 界面張力減小, 蛋白在相間的傳遞及在相中的擴散阻力大大減小, C-PC分子遠離界面, 更易進入上相PEG, 從而導致C-PC純度增加。PEG 1 000的提取效果最好, 基本符合了分子質量越低越利于蛋白質富集的規律。

圖3 體系PEG分子質量對C-PC純度的影響Fig. 3 The influence of PEG molecular weight on the purity of C-PC

2.4 TLL對C-PC純度的影響

TLL是雙水相體系組成的關鍵因素, 其中的每個點都代表著不同 PEG和鹽的質量分數的組成成分。分子質量高于10 000 親水性蛋白, 比較容易進入TLL小于 40%(質量分數)的雙水相體系[18]。因此在PEG1 000和酒石酸鉀鈉雙水相體系中, 選擇中、短的TLL(質量分數)： 14.66%、21.65%、26.51%、30.26%、33.47%。在Vr一定的情況下, 比較不同TLL對C-PC純度的影響, 以C-PC純度為縱坐標,Vr為橫坐標, 結果見圖4。C-PC的純度與TLL呈現負相關。當Vr一定時, C-PC的純度隨TLL的增加, 呈下降趨勢,即TLL越大, C-PC的純度越低。TLL為14.66%時, 其C-PC的純度雖然最高, 但其相分離的時間很長, 因為TLL越小, 越接近雙結線, 越接近臨界值。TLL為21.65%時, 其C-PC的純度僅略低于TLL為14.66%, 但相分離的時間較短, 因此, 選擇TLL為21.65%繼續試驗。

圖4 TLL對C-PC純度的影響Fig. 4 The influence of TLL on the purity of C-PC

2.5 不同Vr對C-PC純度的影響

Vr對C-PC純度的影響非常顯著。在TLL一定的情況下, 比較不同的上、下相體積比Vr對 C-PC純度的影響。以C-PC純度為Z軸坐標,Vr為Y軸坐標,TLL為X軸坐標, 結果見圖5。C-PC的純度與Vr呈現負相關。當TLL一定時, C-PC的純度隨著Vr的減少, 呈上升趨勢即Vr越小, C-PC的純度越高。在TLL為21.65%,Vr為 0.22時, C-PC的純度最高達到1.27。Vr變小, 即上相體積減少, 使上相可利用空間減少, 總蛋白的空間變小, 非目的蛋白隨著下相體積的增大, 更多分配到下相, 目的蛋白C-PC的純度提高。其他藻也表現出相同的分離行為[8]。但是與PEG4000提取新鮮螺旋藻[14]表現出行為正好相反。可能是因為 PEG的分子質量的增大, 影響了雙水相體系的疏水性。

圖5 Vr對C-PC純度的影響Fig. 5 The influence of Vr on the purity of C-PC

2.6 不同TLL和Vr對C-PC回收率的影響

不同的TLL和不同的Vr對C-PC回收率的影響。以C-PC回收率為Z軸坐標,Vr為Y軸坐標,TLL為X軸坐標, 結果見圖6。Vr對C-PC回收率的影響非常顯著。在不同的TLL中, 回收率和Vr呈現明顯的正相關, 隨Vr的減少, 回收率呈下降趨勢。在TLL33.47%,Vr 2.11處C-PC的回收率最高達到95.64%。在體系獲得最高純度 1.27, 回收率為 85.11%。雖然體系對C-PC的最大回收率在TLL為33.47%處獲得,但當Vr一定時,TLL對回收率的影響并不顯著。所有配比的回收率均高于85%。

圖6 系統TLL和Vr對C-PC回收率的影響Fig. 6 The influence of TLL and Vr on the yield of C-PC

2.7 不同相組成質量分數對 C-PC純度的影響

分別在不同TLL上選取不同PEG1 000和酒石酸鉀鈉相組成配比建立雙水相體系, 確定最優組成。以C-PC純度為Z軸坐標, PEG1 000質量分數為Y軸坐標, 酒石酸鉀鈉質量分數為X軸坐標, 結果見圖7。PEG1000和酒石酸鉀鈉構建的雙水相體系的質量分數分別為7.76%和21%, pH 8.06, 系線長21.65%、體積比 0.22純化效果最佳, 純度由 0.42提高到 1.27,純化因子3.04, 回收率85.11%。

圖7 相組成濃度對純度的影響Fig. 7 The influence of components in the ATPS on the purity of C-PC

2.8 多次ATPS對純度的影響

硫酸銨鹽析法, 提高粗提液純度達到1.46。選擇上述最優條件, 建立 PEG/酒石酸鉀鈉雙水相體系。按照一次ATPS配比, 建立多次ATPS。以純度作為Z軸坐標, 雙水相體系萃取(ATPE)的次數作為X軸坐標, 結果見圖8。2次ATPE萃取獲得最高純度3.28,明顯高于1次、3次和4次ATPE的萃取結果。

2.9 C-PC的吸收光譜

圖8 多次ATPS對C-PC純化因子的影響Fig. 8 The influence of multiple ATPE stages on the purity of C-PC

采用紫外-可見光分光光度計對硫酸銨鹽析、2次 ATPS提取的 C-PC進行全波長掃描, 起始波長260 nm, 終止波長700 nm, 結果見圖9。

圖9 C-PC的吸收光譜Fig. 9 The absorption spectrum of the recovery C-PC

2.10 C-PC的熒光測定

測定2次ATPS提取的C-PC的熒光光譜, 結果見圖10。C-PC具有熒光, 峰值在643 nm獲得。經過ATPS萃取提純的C-PC, 具有熒光, 在643 nm處獲得峰值, 相對熒光強度 155.5, 具有的很好的生物活性。

圖10 C-PC的熒光發射光譜Fig. 10 The fluorescence emission spectrum of the recovery C-PC

3 結論

采用廉價的 PEG1000/酒石酸鉀鈉雙水相體系,從干螺旋藻中分離純化 C-PC。實驗結果表明, 雙水相體系濃度為 7.76% (w/w)的 PEG1000、21%(w/w)的酒石酸鉀鈉、TLL為21.65%、Vr為0.22, pH為 8.06時, 蛋白的純度為1.27, 回收率為85.11%。硫酸銨鹽析法提高粗提液純度, 經過2次ATPS, C-PC純度可提高到3.28, 高于藥品級3.0。獲得的 C-PC具有熒光, 生物活性良好。

[1] Show P L, Tan C P, Shamsul A M, et al. Extractive fermentation for improved production and recovery of lipase derived from Burkholderia cepacia using a thermoseparating polymer in aqueous two-phase systems [J].Bioresour Technol, 2012, 116： 226-233.

[2] Naganagouda K, Mulimani V H. Aqueous two-phase extraction (ATPE)： An attractive and economically viable technology for downstream processing of Aspergillus oryzae α-galactosidase [J]. Process Biochem,2008, 43： 1293-1299.

[3] Garza-Madrid M, Rito-Palomares M, Serna-Saldívar S O, et al. Potential of Aqueous Two-Phase Systems constructed on flexible devices： Human serum albumin as proof of concept [J]. Process Biochem, 2012, 45：1082-1087.

[4] Benavides J, Rito-Palomares M. Review practical experiences from the development of aqueous two-phase processes for the recovery of high value biological products [J]. J Chem Technol Biotechnol,2008, 83： 133-142.

[5] Choi J W, Nam Y S, Kim J M, et al. Biomolecular photonic device consisting of Chl a/Chl b/phycoerythrin/phycocyanin hetero structure [J]. Nanoscience and Nanotechnology, 2006, 6(11)： 3526-3531.

[6] Yoshida A, Takagaki Y, Nishimune T. Enzyme immunoassay for phycocyanin as the main component of spirulina color in foods [J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1996, 60： 57-60.

[7] Bhat V B, Madyastha K M. Scavenging of peroxynitrite by phycocyanin and phycocyanobilin from Spirulina platensis： protection against oxidative damage to DNA [J].Biochem Biophys Res Commun, 2001, 285： 262-266.

[8] Benavides J, Rito-Palomares M. Potential Aqueous Two-Phase Processes for the Primary Recovery of Colored Protein from Microbial Origin [J]. Life. Sci,2005, 5 (3)： 259-266.

[9] Ogbonda K H, Aminigo R E, Abu G O. Influence of temperature and pH on biomass production and protein biosynthesis in a putative Spirulina sp [J]. Bioresour Technol, 2007, 98： 2207-2211.

[10] Kula M R, Kroner K H, Hustedt H. Adv. Purification of enzymes by liquid-liquid extraction [J]. Biochem. Eng,1982, 24： 73-118.

[11] Ranjitha K, Kaushik, B D. Putification of phycobiliproteins from Nostoc nuscorum [J]. Sci Ind Res, 2005,64： 372-375.

[12] Anamika P, Sandhya M, Richa P, et al. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat [J]. Protein Exp. Purif, 2005, 40： 248-255.

[13] Patil G, Chethana S, Sridevi A S, et al. Method to obtain C-phycocyanin of high purity [J]. Chromatogr A, 2006,1127： 76-81.

[14] Patil G, Raghavarao K S M S. Aqueous two phase extraction for purification of C-phycocyanin [J].Biochem Eng J, 2007, 34： 156-164.

[15] 于淑坤, 岳思君, 田露, 等. 聚乙二醇-硫酸銨雙水相體系萃取螺旋藻藻藍蛋白的研究[J].食品科技.2012,11： 249-252.

[16] Zhao L, Peng Y, Gao J, et al. Bioprocess intensification：an aqueous two-phase process for the purification of C-phycocyanin from dry Spirulina platensis [J]. Eur.Food. Res. Technol, 2014, 238 (3)： 451-457.

[17] 紀明侯. 海藻化學[M]. 北京： 科學出版社, 1997：489-493.

[18] Cabezas, H. Theory of phase formation in aqueous two phase systems [J]. Chromatogr B, 1996, 680： 3-30.