白血病相關蛋白LRP16 過表達HepG2 穩定細胞系的構建及鑒定

李婷，王安平，李萍，王雙雙，母義明

解放軍總醫院 內分泌科，北京 100853

白血病相關蛋白16（leukemia related protein 16，LRP16）基因是韓為東等于1999年從正常人外周血淋巴細胞中克隆并命名的一個基因，屬于Macro Domain 家族。該基因定位于染色體11q12.23，含11個外顯子，編碼325 個氨基酸殘基構成的蛋白[1-2]。我們前期的研究表明，LRP16 基因對胰島素分泌和胰島素抵抗均有影響。它在脂肪細胞3T3-L1、肌肉細胞C2-C12、肝癌細胞HepG2 中發揮著重要作用，LRP16 過表達可上調多種炎性因子（TNF-α、IL-6）的表達，損傷IRS-1 信號傳導通路（降低pIRS-1、PI3-K、pAkt 的表達），抑制細胞胰島素刺激的葡萄糖攝取，引起外周胰島素抵抗[3-5]。在這些研究中我們采用的是質粒轉染的方式，這一技術一方面只能達到短期轉染，另一方面轉染效率較低。我們想深入研究LRP16 促進胰島素抵抗的分子機制，希望獲得長期穩定的LRP16 過表達細胞株。因此，我們構建了LRP16 過表達的慢病毒表達載體，且成功地感染了HepG2 細胞，獲得穩定過表達LRP16 的細胞株，為深入研究LRP16 抑制肝臟胰島素抵抗的相關機制提供相關技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293T 包裝細胞及人肝癌HepG2 細胞均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和細胞資源中心（CRC/PUMC）；過表達質粒載體EX-Y2069-Lv201 及對照質粒載體EX-NEG-Lv201（表1，圖1）由OmicsLink 公司構建；慢病毒包裝試劑盒Lenti-Pac HIV Expression Packaging Kit、Lenti-Pac HIV and FIV qRT-PCR 滴定試劑盒、第一鏈cDNA 合成試劑盒、2×All-in-One qPCR Mix 均購自Gene Copoeia 公司；MEM 培養基、DMEM 培養基、丙酮酸鈉、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗均購自Gibco 公司；TRIzol 購自Invitrogen 公司；蛋白marker 購自Thermo公司；Western 印跡發光試劑盒購自北京普利萊公司；鼠抗人β-actin抗體購自Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG購自中杉金橋公司；qPCR 引物由Invitrogen 公司合成；LRP16抗體由本實驗室制備保存。

1.2 細胞復蘇與培養

選用25 mL 培養瓶，適量HepG2 細胞，加入5 mL MEM 培養基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素、1 μmol/L 丙酮酸鈉），于37℃、5% CO2培養箱中培養，2 d換液一次，4～5 d傳代一次。

1.3 質粒載體構建及鑒定

對構建的過表達質粒載體EX-Y2069-Lv201 的LRP16 開放讀框（ORF）進行測序，結果與人類LRP16基因（GenBank：NM_014067）序列相符。

1.4 慢病毒包裝

按照Lenti-Pac HIV Expression 慢病毒包裝試劑盒進行下述操作。在轉染前2 d，按每個10 cm的培養皿1.3×106～1.5×106細胞數將HEK293T 包裝細胞接種于培養皿中，用含10%胎牛血清的DMEM 培養基于37℃、5% CO2孵箱中培養，使細胞在轉染時達到70%～80%的密度；在去聚丙烯的試管中，取2.5 μg 病毒過表達質粒EX-Y2069-Lv201 和5.0 μL（0.5 μg/μL）Lenti-Pac HIV mix 稀釋至200 μL 的Opti-MEM 內；取15 μL EndoFectin Lenti，在另一試管中用Opti-MEM 稀釋至終體積為200 μL；將稀釋的EndoFectin Lenti 反應物加入輕微渦旋含DNA 的試管中（添加順序不可顛倒），然后將上述混合物轉移到5 mL 圓底聚丙烯試管Falcon 中；把形成的DNA-EndoFectin 復合物直接加入培養皿，輕輕搖晃培養皿使復合物均勻分布；在37℃、5% CO2孵箱中孵育細胞過夜（8～14 h），用含2%～5%經熱失活的胎牛血清和青霉素、鏈霉素的DMEM 培養基替換過夜的原培養基；加入1/500 體積的TiterBoost 反應物到培養基中，在37℃、5% CO2孵箱中繼續孵育；經48 h轉染，收集含假病毒的培養液到加蓋的試管中，500 r/min 離心10 min 去除細胞碎片；進一步離心，用0.45 μm 孔徑的濾器過濾HEK293T 細胞上清液，得到過表達病毒濃縮液LPP-Y2069-Lv201-400，分裝小管放置于-80℃備用。同樣步驟得到對照病毒濃縮液LPP-NEG-Lv201-100。

表1 載體克隆信息

圖1 過表達質粒載體EX-Y2069-Lv201（A）及對照質粒載體EX-NEG-Lv201（B）信息

1.5 慢病毒滴度測定

HEK293T 細胞傳代，24 孔板中每孔加入1×105細胞，體積為500 μL；次日準備10 支無菌Ep 管，每管加入90 μL 培養基，取待測病毒原液10 μL 加入第1 支管中，混合均勻，取混合均勻的第1 管液10 μL 加入第2 支管中，繼續相同操作直到最后一管；選取所需細胞孔，吸去90 μL培養基，加入稀釋好的病毒溶液，于37℃、5% CO2培養箱中培養；1 d后，加入新鮮培養基500 μL；小心操作；4 d 后抽提RNA，然后采用Lenti-Pac HIV and FIV qRT-PCR 滴定試劑盒提取總RNA，將RNA 逆轉錄為cDNA，實時定量PCR檢測綠色熒光蛋白標記的慢病毒滴度。病毒的滴度等于帶有熒光的細胞數除以病毒原液量，即2/（1E-6）=2E+6 TU/μL，亦即2E+9 TU/mL。確保病毒滴度≥108TU/mL（LPP-Y2069-Lv201-400 為3.87×108TU/mL，LPP-NEG-Lv201-100 為6.25×108TU/mL），以便后續操作。

1.6 慢病毒載體感染HepG2細胞系

將HepG2 細胞計數后鋪到6 孔板中培養，各孔加入2 mL MEM 培養基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素，1 μmol/L 丙酮酸鈉），在37℃、5% CO2條件下培養24 h；鋪板24 h 后，按照MOI=30，每孔加入相應目的基因慢病毒液LPP-Y2069-Lv201-400 和對照慢病毒液LPP-NEG-Lv201-100，混勻后于37℃、5% CO2條件下培養；感染48 h 后，觀察慢病毒侵染結果，拍攝細胞熒光圖片；用胰酶消化感染過的細胞并轉移至6 孔板（每塊6 孔板對應一種慢病毒，留出1 孔用于陰性對照細胞），以含1 μg/mL 嘌呤霉素的MEM 培養基（含10%胎牛血清，1%青鏈霉素，1 μmol/L 丙酮酸鈉）進行藥物篩選培養5～7 d，觀察細胞存活情況和熒光圖片，當細胞熒光圖片與明場細胞相對應，則嘌呤霉素濃度可以減半進行培養；連續加藥培養7 d后，嘌呤霉素濃度減半至0.5 μg/mL 繼續培養，待細胞長滿后收取細胞。

1.7 qPCR檢測LRP16的mRNA表達

從細胞中提取RNA，定量，電泳確定其純度。用第一鏈cDNA 合成試劑盒進行逆轉錄，用Gene Copoeia 公司試劑盒配置所推薦的反應體系后在PRISM 7300（ABI 公司）上進行qPCR 反應。根據LRP16 的基因序列設計PCR 引物（上游引物：5'-A GCTCTTTCACTCGGAGGATT-3'；下游引物：5'-TG GCAAAAGAAGAAGACAAAGC-3'）。以GAPDH 基因為內參，根據GAPDH 的基因序列設計PCR 引物（上游引物：5'-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3'；下游引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'）。反應條件：95℃ 30 s 預變性；95℃ 5 s，60℃ 20 s，72℃10 s，40 個循環。目標基因mRNA 的相對含量通過ΔΔCt計算方法獲得。

1.8 Western印跡檢測LRP16的表達

用自制IP 緩沖液（0.15 mol/L NaC1，20 mmol/L Tris-HC1，10%甘油，0.1% NP-40）加入25×總蛋白酶抑制劑及用100×PMSF 配置的細胞裂解液，分別裂解過表達穩轉株、對照穩轉株和野生型（未轉染）HepG2 細胞，4℃、12 000 r/min 離心后取上清作為樣品，測定蛋白濃度，取等量蛋白樣品進行SDSPAGE 后轉印蛋白至PVDF 膜，用以TBST 液配制的5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h，LRP16 鼠抗以1∶200稀釋，β-actin 鼠抗人以1∶1000 稀釋，4℃反應過夜，用TBST 液洗膜3 次，每次15 min，二抗以1∶5000 稀釋，室溫反應1 h，用TBST液洗膜3次，每次15 min，在膜上滴加發光液后進行曝光。

2 結果

2.1 慢病毒載體感染HepG2細胞株的篩選

按前述方法將HepG2 細胞計數后鋪到6 孔板中培養，每孔加入目的基因慢病毒液LPP-Y2069-Lv201-400 和對照慢病毒液LPP-NEG-Lv201-100，感染48 h 后，觀察慢病毒侵染結果，拍攝細胞熒光圖片（圖2）。可以看出，轉入LPP-Y2069-Lv201-400 和LPP-NEG-Lv201-100 慢病毒后的HepG2 細胞，其綠色熒光蛋白表達超過90%。

2.2 過表達慢病毒感染HepG2 細胞后對LRP16 基因表達的影響

提取過表達穩轉株、對照穩轉株和野生型（未轉染）HepG2 細胞總RNA，采用實時熒光定量PCR 檢測各組細胞的LRP16 相對表達量。結果顯示，過表達穩轉株LPP-Y2069-Lv201-400 中LRP16 目的基因的表達量為對照穩轉株LPP-NEG-Lv201-100 的128.64倍（表2）。

2.3 HepG2 細胞的感染和Western 印跡分析LRP16蛋白的過表達效果

將獲得的LRP16 基因過表達的HepG2 細胞、過表達對照細胞及野生型HepG2 細胞分別培養4～5 d，在培養皿中加入適量細胞裂解液提取蛋白，用上清液行SDS-PAGE，轉膜后進行蛋白免疫印跡分析。結果顯示空白組和對照組細胞在相對分子質量約28×103處均出現了微弱條帶，而過表達組出現明顯的粗黑條帶，表明過表達穩轉株LPP-Y2069-Lv201-400 的LRP16 表達量明顯高于對照穩轉株LP-NEG-Lv201-100和野生型HepG2（圖3），結果與實時熒光定量PCR一致。

表2 qPCR檢測過表達穩轉株、對照穩轉株及野生型HepG2細胞中LRP16 mRNA水平

圖2 LRP16過表達穩定株（A）及對照穩定株（B）熒光轉染情況

圖3 Western印跡檢測LRP16蛋白表達的差異

3 討論

前期，我們做了大量LRP16相關研究，發現它是機體發育過程中不可或缺的一個基因，其表達不僅與腫瘤的發生發展密切相關[6-7]，也參與了胰島素的分泌及胰島素外周器官的胰島素抵抗作用。

隨著糖尿病發生率的上升，胰島素抵抗一度成為近年的研究熱點，胰島素通路受到重視。而我們發現的LRP16 基因參與胰島素抵抗立刻引起了關注。但目前我們的發現大多停留在表明現象，真正所涉及到的機制研究甚少。

因為肝臟是胰島素發揮作用的重要外周器官，而且之前我們也曾在肝癌HepG2 細胞系中研究過LRP16的作用，所以，在深入研究LRP16基因對胰島素信號通路的影響機制時，我們仍然選用這一常用的肝癌細胞系。此LRP16 基因過表達的HepG2 穩定細胞系的建立，為我們今后的研究提供了一個長期有效的研究工具。

[1]韓衛東,于力,樓方定,等.一個新的白血病相關基因LRP16全長cDNA 的克隆、序列分析及表達特征[J].中國生物化學與分子生物學報,2001,17(2):209-204.

[2]于力,韓衛東,樓方定,等.新的白血病相關基因LRP16 的克隆[J].軍醫進修學院學報,2000,21(2):81-84.

[3]臧麗,呂朝暉,汪保安,等.LRP16 通過下調PPARγ表達抑制細胞葡萄糖攝取[J].中華內分泌代謝雜志,2010,26(3):217-220.

[4]臧麗,母義明,呂朝暉,等.LRP16基因抑制IRS-1信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體γ轉錄活性導致C2-C12 成肌細胞胰島素抵抗[J].中華醫學雜志,2011,91(20):1408-1412.

[5]臧麗,母義明,呂朝暉,等.人白血病相關蛋白16 基因對3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取及過氧化物酶體增殖物激活受體γ活性的影響[J].中國糖尿病雜志,2011,19(4):293-297.

[6]Meng Y G,Han W D,Zhao Y L,et al.Induction of the LRP16 gene by estrogen promotes the invasive growth of Ishikawa human endometrial cancer cells through the downregulation of E-cadherin[J].Cell Res,2007,17:869-880.

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