Espin為Usher綜合征II型候選致病基因

韋 博，郝繼龍，吳新民，王 樂＊

（1.吉林大學中日聯誼醫院 神經外科，吉林 長春130033；2.吉林大學第一醫院 眼科，吉林 長春130021）

Usher綜合征是一種以漸進性的視力下降和聽力損失或耳聾為主的一種綜合征[1－3]。視力喪失表現為視網膜色素變性，視網膜感光細胞受損后視力下降，聽力主要表現先天性不同程度的聽力喪失。眾所周知，whirlin，espin，vlgr－1這3個蛋白在視網膜感光細胞的連接纖毛和內耳耳蝸毛細胞里組成USH2蛋白復合體，其中任何一個蛋白的缺失都會導致USH2疾病的發生，但這3個蛋白并不能完全解釋該疾病的發生，所以我們相信還有更多未知的蛋白參與USH2蛋白復合體的組成，這些蛋白極有可能是組成USH2蛋白復合體的重要蛋白，而編碼這些蛋白的基因也是USH2候選基因之一[4－6]。我們用酵母雙雜交發現espin是USH2蛋白復合體的一個新成員，為研究USH2復合體的生物功能及由于這個復合體的缺陷導致Usher綜合征II型的機制提供了嶄新的研究途徑。

1 資料與方法

1.1 儀器和試劑

共聚焦顯微鏡（model FV1000，Olympus，Tokyo，Japan）。源于兔的多克隆espin抗體（K－14）購于Santa Cruz生物技術公司。源于兔的多克隆GFP抗體購買于Abcam。鏈霉素和所有二抗都購買于Invitrogen公司（Carlsbad，CA）。

1.2 實驗方法及步驟

1.2.1 引物設計和PCR擴增 從小鼠視網膜克隆出來的whirlin全長cDNA（NP＿082916）。根據生物信息學預測結果設計一對特異性引物（Invitrogen公司合成），以鼠來源的基因組為模板進行PCR擴增，反應條件為95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃60s，循環30次。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.2 熒光素酶載體的構建 擴建得到的998bp產物凝膠電泳純化回收后，用限制性內切酶EcoR I和BamH I雙酶切，再用PCR產物純化試劑盒純化。分別酶切純化的擴增片段和質粒片段用T4DNA連接酶連接后轉化感受態E.coli DH5α細胞，先菌液PCR初步篩選陽性克隆，再通過雙酶切和測序驗證，即得到含有whirlin的cherry的重組質粒。同理操作含有 whirlin的pEGFP－C2，pDsRed2－C1質粒；pcDNA3.1（－）質粒。上述DNA重組質粒均已經過DNA測序證實正確。

1.2.3 細胞培養 COS－7細胞和HEK293細胞都用含有5%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的DMEM培養液培養。當細胞覆蓋率達到60%左右，參照TurboFectTM體外轉染試劑說明書對細胞實行瞬間轉染，12h后觀察其熒光蛋白的表達，并進行一次更換細胞培養液。再孵育6h。待熒光表達充分后置于共聚焦顯微鏡下觀察并照像。

1.2.4 免疫共沉淀 將轉染成功的HEK293細胞，用細胞裂解液裂解細胞后并用超聲波間斷超聲裂解，離心轉數18 000g，10mim，將上清液中加入蛋白G，充分搖勻1h，離心后向上清液中加入一抗搖勻3h，離心轉數18 000g 8min。于上清液中加入蛋白G，搖勻1h。，用裂解液洗沉淀物3次，再煮沸10min。所有實驗步驟均在4。C條件下進行操作。最后將實驗產物進行western－blot。PVDF膜用含有8%脫脂牛奶孵育1.5h，加入相應的一抗抗體于4℃過夜孵育，洗滌5min，共3次，再加入相應的二抗孵育1h，最后進行顯色，觀察所需的蛋白條帶。

1.2.5 共定位分析 于倒置顯微鏡下觀察轉染成功并可見熒光蛋白表達的COS－7細胞，用4%福爾馬林在－20℃條件下固定細胞5min，洗滌后用5%山羊血清（Goat Serum，GS）／PBS孵育2h，一抗4℃孵育24h，洗滌后用相應的二抗孵育1h，Hoechst dye 33342／5%GS／PBS孵育3min，覆蓋蓋玻片后于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察、照像保存染色結果。

2 結果

2.1 免疫共沉淀證明 Whirlin與Espin相互作用

證實whirlin與espin相互作用，我們用whirlin質粒和用帶GFP熒光的espin質粒轉染HEK293細胞，進行免疫共沉淀實驗 （圖1），結果發現來源于兔的whirlin抗體能夠沉淀下用GFP標記的espin蛋白，說明這兩個蛋白存在相互作用 （圖1）。

圖1 Whirlin與espin相互作用

2.2 細胞共轉染證明whirlin與espin在細胞質中共定位

在whirlin單獨轉染的細胞中，沒有標記的whirlin表現出彌漫的信號模式。在whirlin和espin雙轉染的細胞，我們進行染色并仔細觀察，我們發現這兩個蛋白在細胞質中部分共定位。whirlin和espin的部分共定位同樣表明whirlin和espin很有可能存在相互作用（圖2）。

3 討論

最新研究發現，在野生鼠中，肌動蛋白和靜纖毛偶聯蛋白對靜纖毛發育都尤為重要。Espin是一種偶聯肌動蛋白（actin）微絲，并促進肌動蛋白肌束的形成，主要通過阻止一端肌動蛋白肌束拆卸的同時，在另一端和促進肌動蛋白微絲聚合，從而使肌動蛋白束不斷延長或者穩定。Espin蛋白主要在內耳和睪丸中表達，內耳的靜纖毛主要負責將聲波轉化為肌電反應，是由許多緊密連接、排列均勻一致的極性肌動蛋白微絲構成[7－9]。通過對whirlin與espin的相互作用研究，我們發現在體外whirlin與espin部分共定位，兩蛋白之間存在直接的相互作用。這對于研究USH綜合征II型的發病機制提供了新的線索和方向。但至于這兩個蛋白在什么情況下結合，在怎樣的條件下還有待于我們進一步研究和探討。

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