Espin多個結構域與whirlin在體外細胞中熒光蛋白表達共定位

王 樂，隋 源，王 顏，韋 博，郝繼龍

（1.吉林大學第一醫院 眼科，吉林 長春130021；2.吉林大學生命科學學院，吉林 長春130012；3.長春市中心醫院 腎病科，吉林 長春130051；4.吉林大學中日聯誼醫院 神經外科，吉林 長春130033）

Usher綜合征是一種常見的累及眼和耳疾病的綜合征[1－3]。1858年，第一次描述這個疾病的特征是由一位德國眼科醫生Albrecht von Grafe開始的，之后便以他的名字命名[4]。1914年，一位英國眼科醫生，在69例遺傳疾病的基礎上再次報道這種疾病[5]。該病視力受損首先表現夜盲，進而周邊視野逐漸縮小，最終形成管狀視野。聽力受損也是漸進性聽力喪失，最終耳聾。依據他們的嚴重程度和發病時間，Usher綜合征主要分為3種類型，Usher綜合征I型，Usher綜合征II型，Usher綜合征III型[6，7]。以往研究證明espin全長和whirlin全長相互作用，espin是USH2蛋白復合體里的新成員。但espin的哪個結構域和whirlin存在相互作用還不是很清楚。這對于我們進一步研究USH綜合征的發病機制起到非常重要的作用。

1 資料與方法

1.1 儀器

PCR儀、電泳儀、電泳槽、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡（FV1000，奧林巴斯，東京，日本）。

1.2 實驗方法及步驟

圖1 espin結構域示意圖

1.2.1 如圖1所示，espin由espin＿A，espin＿P，espin＿WH和espin＿M 4個結構域組成，用PCR得到目的基因（片段大小依次為1 050bp、950bp、665bp、488bp），限制性內切酶EcoR I和BamH I雙酶切酶切目的基因及GFPC2載體，最終得到 GFP－espin A、GFP－espin P、GFP－espin WH、GFP－espin M質粒。以上所有質粒均經過基因測序檢測驗證。

1.2.2 細胞培養 于37℃恒溫箱培養COS－7細胞，DMEM培養液中加入5%胎牛血清。孵育COS－7細胞24h后，用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）體外進行瞬間轉染，即：將0.4μg的兩種目的質粒稀釋在30μl的不含胎牛血清的DMEM培養液中，取2μl Lipofectamine 2000加入30μl不含胎牛血清的培養基中，室溫放置10min。最后加入相應細胞培養液中孵育10h。置于共聚焦顯微鏡下照像并保存圖像。

2 結果

2.1 Espin由4個結構域組成

Espin由espinA、espinP、espinWH和espinM 4個結構域組成。EspinA有8個并列相連重復序列組成，espinP主要由脯氨酸組成，espinWH是類似威斯科特奧爾德里奇綜合征同源蛋白結構域，espinM是促進肌動蛋白束形成。紅色，藍色，黃色和綠色的長方形分別在代表espinA、espinP、espinWH和espinM（圖1）。

2.2 Espin多個結構域與whirlin在體外細胞中熒光蛋白表達共定位

分別把 gfp－espinA、gfp－espinP、gfp－espinWH 和 gfp－espinM 4個質粒和mCherry－whirlin轉染入COS－7細胞中，從熒光蛋白表達來看，我們發現含有gfp－espinA、gfp－espinP和gfp－espinM這3個espin結構域的質粒的熒光蛋白表達都和whirlin全長質粒的熒光蛋白表達共定位，只有gfp－espinWH質粒的熒光蛋白表達沒有和whirlin全長的熒光蛋白表達共定位 （圖2）。

3 討論

從實驗結果來看，在 COS－7細胞中，gfp－espinA、gfp－espinP和gfp－espinM這3個espin結構域的質粒的熒光蛋白表達都和whirlin全長質粒的熒光蛋白表達共定位，提示這3個結構域極有可能參與蛋白之間的相互作用，我們推斷espinA和espinP極有可能是調控下游espinM和肌動蛋白相互作用。但是gfp－espinWH質粒的熒光蛋白表達沒有和whirlin全長的熒光蛋白表達共定位，前面提到espinM是促進肌動蛋白束形成，espin微絲和肌動蛋白束相結合一起，從實驗結果來看，Gfp－espinWH質粒熒光蛋白表達是細長微絲，mCherry－whirlin質粒熒光蛋白表達是彌漫形，二者很明顯沒有共定位，至于espinWH結構域起到什么樣的作用有待于進一步驗證。

圖2 Espin多個結構域與whirlin在體外細胞中熒光蛋白表達共定位

[1]Boughman JA，Vernon M，Shaver KA.Usher syndrome：definition and estimate of prevalence from two high－risk populations[J].J Chronic Dis，1983，36（8）：595.

[2]Hartong DT，Berson EL，Dryja TP.Retinitis pigmentosa[J].Lancet，2006，368（9549）：1795.

[3]Keats BJ，Corey DP.The usher syndromes[J].Am J Med Genet，1999，89（3）：158.

[4]A.von Graefe.Vereinzelte Beobachtungen and Bemerkungen.Exceptionelles Verhalten des Gesichtsfeldes bei Pigmententartung des Netzhaut.Albrecht Graefes Arch[J].Klin.Ophthalmol，1858，4，250.

[5]C.H.Usher.On the inheritance of retinitis pigmentosa，with notes of cases.R.Lond[J].Ophthalmol.Hosp.Rep，1914，19，130.

[6]Williams DS.Usher syndrome：animal models，retinal function of Usher proteins，and prospects for gene therapy[J].Vision Res.2008，48（3）：433.

[7]Yang J，Wang L，Song H，et al.Current understanding of usher syndrome type II[J].Frontiers in Bioscience in press，2012，17（1）：1165.