呼吸道分離鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力與耐藥性關系的研究

劉 原，柯 蕊，楊 妮，趙玉杰，2，和 平，馮雁京，張立然，耿 燕

（1.西安交通大學第二附屬醫院 呼吸內科；2.西安交通大學第二附屬醫院重癥醫學科；3.西安交通大學第二附屬醫院 檢驗科，陜西 西安710004）

隨著抗生素的廣泛使用，鮑曼不動桿菌的感染率逐年上升，其中80%的患者感染途徑為呼吸道，科室分布也以呼吸內科為主，在患者機體免疫功能受損或抵抗力下降時引起肺部感染或合并肺部感染最為常見[1]。加強對呼吸系統鮑曼不動桿菌的耐藥機制研究非常必要。既往研究發現鮑曼不動桿菌廣泛以生物被膜（Biofilm，BF）的形式存在[2]，但有關呼吸道分離的鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力與細菌耐藥性之間的關系尚無相關報道。本研究旨在探討呼吸道分離鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力與耐藥性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2014年3月至2014年12月西安市具有代表性的六所三級甲等綜合醫院臨床痰標本中分離鑒定的非重復鮑曼不動桿菌178株。大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853為藥敏試驗質控菌株，鮑曼不動桿菌A601為生物被膜陽性對照株。

1.1.2 主要儀器 Vitek－2細菌全自動鑒定儀（法國梅里埃生物公司），96孔板酶標儀（德國BMG Lab Technologies公司）。

1.1.3 主要試劑 MH 瓊脂粉，LB培養基，0.25%（v／v）結晶紫染液，分析純無水乙醇。藥敏紙片均購自英國Oxoid公司。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗 采用K－B法測定14種抗生素的敏感性。用精度為1mm的游標卡尺測量并記錄藥敏平板的抑菌圈直徑。結果按照（Clinical and Laboratory Standards Instltute，CLSI）2013年版標準進行操作和結果判斷。

1.2.2 生物被膜形成時間測定 依據參考文獻方法[3]略作改進：隨機挑選18株臨床菌株和生物被膜陽性株，制備濃度為1×109CFU／ml的過夜菌液，取20ml接種于聚乙烯96孔板（每孔含200ml LB培養基），每株菌做6個復孔，另設陰性對照，37℃靜置培養，24小時換液，連續7天用酶標儀測定。測定前用無菌蒸餾輕洗3次，除去浮游菌，自然風干后加入0.25g／L結晶紫染液200ml，室溫染色20 min，用蒸餾水洗去染液，自然風干后用95%乙醇萃取10min。用酶標儀測定其在590nm處的吸光度（OD）值，計算6個復孔的平均值，繪制生長曲線。重復測定3次。

1.2.3 生物被膜形成能力測定 按照上述方法，對收集的178株鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力進行測定，每株菌做3個復孔，設陰性和陽性對照，24小時換液，于第5天測定其在590nm處的吸光度（OD）值，重復測定3次。結果判定參照文獻[4]：空白對照OD值的均值±標準差定義為ODc，待測菌株的OD值與ODc比較，OD≤2＊ODc為生物被膜形成陰性株；OD＞2＊ODc為生物被膜形成陽性株，其中，2＊ODc＜OD≤4＊ODc為生物被膜形成能力弱菌株，OD＞4＊ODc為生物被膜形成能力強菌株。

2 結果

2.1 藥敏結果

178株臨床分離株體外藥物敏感試驗結果見表1。其中對頭孢類二代、三代、四代耐藥率均較高，均大于65%；單酰胺類氨曲南、喹諾酮類、磺胺等均有較高的耐藥率；氨基糖甙類阿米卡星的耐藥率較低；對加入酶抑制劑的頭孢菌素類的耐藥率亦低，對碳青霉烯類的耐藥率最低。

2.2 生物被膜形成時間測定結果

對19株鮑曼不動桿菌生物被膜形成時間動態監測：按照生物被膜形成趨勢分為三組，見圖1，生物被膜形成能力較強的3株（包括生物被膜陽性對照株），形成能力較弱的有8株，無生物被膜形成能力的有8株。在培養48h內生物被膜生長緩慢，第3天時生物被膜形成速度最快，到第4、5天時生長速度減緩逐漸達到平臺期，第6、7天時呈負增長趨勢或漲幅速度變慢。選擇生物被膜生長成熟的第5天為檢測點。

2.3 生物被膜形成能力測定結果

對培養至第5天的178株鮑曼不動桿菌進行生物被膜形成能力的半定量測定：46.07%（82株）生物被膜形成陰性；53.93%（96株）生物被膜形成陽性，其中11.80%（21株）生物被膜形成能力強，42.13%（75株）生物被膜形成能力弱。

圖1 鮑曼不動桿菌在590nm處的吸光度值（OD值）

2.4 生物被膜形成能力與耐藥性之間的相關性分析

比較鮑曼不動桿菌生物被膜陽性株與生物被膜陰性株對常用抗菌藥物的耐藥率發現，除亞胺培南、美羅培南、頭孢呋辛、頭孢曲松、氨曲南外，生物被膜形成陰性株對其余九種抗生素的耐藥率高于生物被膜陽性株。鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力與耐藥性密切相關。見表1。

3 討論

細菌形成生物被膜后，由于生物被膜的物理屏障作用和膜內的特殊微環境，使其耐藥性顯著提高[5]。然而，細菌生物被膜的形成能力受環境及自身遺傳特質的影響，調控機制非常復雜，目前關于細菌生物被膜形成能力與耐藥性的關系尚無定論。Rao[6]發現鮑曼不動桿菌生物被膜陽性株對頭孢肟、氨曲南、阿米卡星、環丙沙星的耐藥率高于生物被膜陰性株；Rodriguez－Bano等[7]發現鮑曼不動桿菌生物被膜形成陽性株對亞胺培南及環丙沙星的耐藥率低于生物被膜形成陰性菌株。然而Wroblewska等[8]研究提示鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力與其對碳青霉烯類抗生素的耐藥性無相關性。

本研究發現對于耐藥率普遍較低的藥物（如亞胺培南和美羅培南）及耐藥率普遍較高的藥物（如頭孢呋辛、氨曲南），鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力與耐藥性之間無統計學差異，對其余九種抗生素生物被膜形成陰性株的耐藥率高于生物被膜形成陽性株。與 Rodriguez－Bano[4]的研究部分一致，但與Rao[3]的報道相反，可能原因有：1）對于某些臨床常用的或傳統抗生素，幾乎所有的鮑曼不動桿菌都對其耐藥，如：頭孢呋辛、頭孢曲松。同樣，對于某些使用頻率較低或新型抗生素，大多數鮑曼不動桿菌都對其敏感，如亞胺培南、美羅培南。由于抗生素的使用習慣和頻率的差異所造成的抗生素選擇壓力可能導致這一結果的出現；2）細菌在形成生物被膜后耐藥性提高，但就細菌個體而言，由于生物被膜的屏障作用使生物被膜微環境中抗生素的濃度較低，而且由于生物被膜內細菌的緊密結合使抗生素的結合位點減少，生物被膜形成陽性菌株面對的抗生素壓力較生物被膜形成陰性菌相對小，其個體適應能力或許低于浮游狀態的菌株。相反，生物被膜陰性菌株多以浮游菌狀態存在，在抗生素的選擇壓力下，其耐藥基因的水平轉移及耐藥基因突變的積累可能較生物被膜形成陽性株更為活躍，使細菌個體獲得較高的耐藥性[9]。

表1 生物被膜形成能力不同的鮑曼不動桿菌對14種抗菌藥物耐藥性的比較

本研究還發現形成能力不同的菌株其動態生長曲線也不盡相同，但均能體現生物被膜形成的不同階段。在培養48小時內生長曲線較平坦，對應為定植與不可逆結合階段。培養至第3天時生長曲線漲幅速度最快，與生物被膜成熟前期相對應。生物被膜成熟期表現為到培養的第4、5天時生物被膜生長速度減緩。培養至第6、7天時生長曲線漲幅速度變慢或呈負增長趨勢，對應于生物被膜成熟后期。在對鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力的測定發現，53.93%的菌株生物被膜形成陽性，低于Rao[6]和王政[3]等的報道。上述實驗結果的差異可能與實驗室條件、操作以及細菌自身遺傳因素的影響有關。

綜上，呼吸道鮑曼不動桿菌多可形成生物被膜，提示生物被膜是呼吸道分離鮑曼不動桿菌提高其環境適應能力的方式之一。呼吸道分離的鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力與耐藥性呈負相關，可能與生物被膜產生的耐藥屏障作用以及菌株個體耐藥性的提高有關，但具體相關機制還需進一步研究。

[1]陳佰義，何禮賢，胡必杰，等.中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識[J].中華醫學雜志，2012，92（2）：76.

[2]Mcqueary C N，Actis L A.Acinetobacter baumannii Biofilms：Variations Among Strains and Correlations with Other Cell Properties[J].Journal of Microbiology，2011，49（2）：243.

[3]王 政，劉 丁，黃冬梅，等.鮑曼不動桿菌臨床分離株生物被膜形成能力與耐藥性的研究[J].中國病原生物學雜志，2010，5（6）：405.

[4]Stepanovic S，Vukovic D，Dakic I，et al.A modified microtiter－plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation[J].Journal of Microbiological Methods，2000，40（2）：175.

[5]Ahya A，Saghar H，Parisa M，et al.Assessment of Biofilm Formation and Resistance to Imipenem and Ciprofloxacin among Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii in Tehran[J].Jundishapur J Microbiol，2014，7（1）：e8606.

[6]Rao R S，Karthika R U，Singh S P，et al.Correlation between biofilm production and multiple drug resistance in imipenem resistant clinical isolates of Acinetobacter baumannii[J].Indian Journal of Medical Microbiology，2008，26（4）：333.

[7]Rodriguez－Bano J，Marti S，Soto S，et al.Biofilm formation in Acinetobacter baumannii：associated features and clinical implications[J].Clinical Microbiology and Infection，2008，14（3）：276.

[8]Wroblewska M M，Sawicka－Grzelak A，Marchel H，et al.Biofilm production by clinical strains of Acinetobacter baumannii isolated from patients hospitalized in two tertiary care hospitals[J].FEMS Immunology and Medical Microbiology，2008，53（1）：140.

[9]Abdi－Ali A，Hendiani S，Mohammadi P，et al.Assessment of Biofilm Formation and Resistance to Imipenem and Ciprofloxacin among Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii in Tehran[J].Jundishapur J Microbio.，2014，7（1）：e8606.