TGFβ1／smad7信號通路在大鼠肝纖維化發生中的活化及意義＊

余曉紅，鄭穎娟，呂宏迪，楊 旸，楊廷桐

肝纖維化是由多種原因引起肝小葉結構破壞和細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）過度沉積的結果，尋求防治肝纖維化已經成為當前醫學界的重中之重。因此深入研究探討誘導ECM沉積的原因，阻斷這個過程，可能成為臨床上預防肝硬化重要的環節。轉化生長因子 β1（transforming growth factor－β，TGF－β1）／Smad7 通路具有刺激成纖維細胞增生，促進組織器官纖維化形成等作用，但其在肝纖維化發生中的機制尚不清楚，國內外尚少見研究報道，因此深入研究TGF－β1／smad7信號傳導通路在肝纖維化中激活與作用，對于闡明肝纖維化發病機制意義重大。并可對臨床上防治肝的纖維化提供新的思路。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥品及試劑 CCl4（天津市北宏試劑廠），TGF－β1、Smad3、Smad7 （北京中生物技術有限公司），RT－PCR試劑盒及相關試劑 （北京賽百盛公司）。

1．1．2 動物 健康清潔級 Wistar大鼠 （scxk豫2007－0001）40 只，雌雄各半，體質量（180±20） g，購自河南省實驗動物中心。

1．2 方法

1．2．1 肝臟纖維化模型建立 將Wistar大鼠40只隨機均分為兩組。對照組20只，給予腹腔注射0．9%氯化鈉注射液，模型組20只，給予腹腔注射10%的CCl4，每周2次，連續8周。8周后用10%水合氯醛 0．3ml／kg 麻醉處死，經門靜脈采血 2ml，1500 r／min離心5min，取上清備用。取肝臟組織，一部分肝組織固定于10%甲醛中，另一部分肝組織儲存于液氮備用。

1．2．2 檢測項目 血清 TGF－B1、ALT（丙氨酸轉氨酶）和HA檢測：采用Olympas7100全自動生化儀酶法和放射免疫法檢測。

1．2．3 肝組織病理學觀察 取肝組織經脫水，浸蠟，石蠟包埋，常規制片，4μm切片，HE染色在Olympus BX51光學顯微鏡下觀察。炎性反應分級及纖維化分期參見文獻［1］。

1．2．4 Western blot分析 取適量模型組與對照組肝組織，提取總蛋白，用Bradford法測定蛋白含量。取50μg總蛋白變性5min后進行 SDS－PAGE電泳，分離后的蛋白10 V恒壓35min轉移至硝酸纖維素膜（NC膜）。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用含0．05%Tween－20 的 Tris緩沖液（TBST）洗滌 NC 膜 3次，加入 1∶100 稀釋的 TGF－β1，Smad3，Smad7 特異抗體，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標志的二抗（1∶1 000 稀釋），室溫 2 h，洗膜后加入化學發光 （electrochem－iluminescence，ECL）試劑顯色曝光。以β－actin為上樣量的內參照，用相對吸光度值（目的基因條帶吸光度值／β－actin條帶吸光度值）表示 TGF－β1，Smad3，Smad7 蛋白的相對表達強度。應用 Olympus BX51光學顯微鏡觀察，攝影。采用北京航空航天大學病理圖像分析系統分析結果，每個樣本取3張切片，每張切片取5個視野進行光密度值分析。

1．2．5 肝組織 TGF－β1、Smad3 和 Smad7 表達的檢測 用RT－PCR法，采用Trizol試劑一步法提取肝組織總RNA，合成cDNA，PCR擴增。PCR引物設計如下：

TGF－β1 5＇－ACCTGCAAGACCATCCACATG－3＇5＇－GGTTTTCTCATAGATGGCATT－3＇ 258 bp Smad3 5＇－TGATCACATTTCGATATTCATC－3＇5＇－TCAGCTTCTCTGATCCTGTGTAC－3＇ 306 bp Smad7 5＇－CCATTCCTCGGAATCGATAGACG－3＇5＇－TCATTCCTCGGAATCGATAGACG－3＇ 469 bp β－actin 5＇－AAGCCCATCACCATCTTCCACGA－3＇5＇－CCTTCCCTCACCAGTTTACTTG－3＇ 124 bp

反應條件如下：反應條件為94℃ 5min；94℃30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30 個循環；72 ℃ 10min。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀觀察，應用法國VL公司BIO－PROFIF凝膠圖像分析系統Bio－1D分析軟件對目的電泳條帶進行分析，以目的基因條帶與內參照β－actin條帶吸光度值之比表示表達量。

1．3 統計學分析 所有數據以均使用 SPSS 17．0統計軟件處理。

2 結 果

2．1 兩組血清ALT、HA和 TGF－β1表達水平 模型組血清 ALT （178．46±24．37）U／L，HA （693．38±206．36） μg／L ，TGF－β1（73．95±28．38） U／L，分別明顯 高于對 照組的 （42．81±8．38）U／L，（59．36±28．13） μg／L，（20．69±17．86） U／L（P＜0．01）。

2．2 兩組肝組織病理觀察 對照組大鼠肝小葉中央靜脈、肝肝索、肝竇結構正常，無肝細胞壞死及纖維組織增生；模型組小鼠肝組織小葉內可見點狀或灶狀肝細胞壞死伴炎性細胞浸潤，匯管區可見纖維組織增生，并向肝小葉內穿插，形成纖維間隔。見圖1。

圖 1 對照組與模型組肝組織病理觀察（HE×10）

2．3 Western blot結果 TGF－β1、Smad3 和 Smad7蛋白在模型組與對照組中的表達是 TGF－β1，Smad3，模型組光密度值明顯高于對照組（P＜0．01），Smad7模型組光密度值明顯低于對照組 （P＜0．01）。見圖 2，表 1。

圖 2 Western blot分析結果

2．4 兩組肝組織中 TGF－β1、Smad3、Smad7 的表達在模型組肝組織TGF－β1、Smad3 mRNA表達明顯高于對照組（P＜0．01）；而對照組中 Smad7 mRNA表達明顯高于模型組（P＜0．01），見圖 3，表 1。

圖 3 RT－PCR 檢測 TGFβ1，Smad3，Smad7 mRNA在模型組和對照組肝組織中的表達

表 1 兩組肝組織中蛋白與基因 TGF－β1、Smad3、Smad7（x±s）

3 討 論

轉化生長因子1（transforming growth factorbeta1，TGF－β1）是一種具有多向生物學效應的多肽類細胞調節因子［2］，其主要通過 TGF／Smad 信號通路發揮生物學效應，對其作用機制的深入闡述有非常重要的意義［3］。Smad 蛋白是 TGF－β1 跨細胞膜傳入的重要蛋白，TGF－β1與細胞膜上的 TGF－βRII結合后，活化 TGF－βRI，使 Smad2或 Smad3 C 末端磷酸化，并與Smad4形成異聚體轉錄復合物，移位至細胞核與序列特異的DNA結合，誘導基因轉錄，誘導使肝臟纖維化產生和發生發展。Smad7基因是TGF－β1信號傳導通路的抑制元件，通過與活化的TGF－βI型受體結合，一方面抑制Smad2、Smad3的磷酸化，另方面抑制Smad2、Smad3與受體結合，在TGFβ信號傳導中構成負反饋環路，發揮抗纖維化作用。TGF－β1是激活HSC的主要細胞因子之一，是最強的肝纖維化促進劑［4］，本研究顯示在肝臟纖維化的肝組織中Smad7的表達明顯減少，在對照組中呈現高表達。而TGF－β1、Smad3蛋白在對照組正常肝組織中低表達，在肝臟纖維化中呈現高表達。并且蛋白和基因的表達呈現一致性。證明了肝纖維化發生時TGF－β1／Smads通路的信號分子存在過度活化。同時Smad7的功能明顯的減弱。說明這種基因的明顯變化證明是肝臟纖維化發生的重要基礎。

慢性乙肝是肝硬化和肝細胞癌的高危因數，亞洲地區目前屬其感染的高流行區［5，6］。肝纖維化是慢性肝病發展為肝硬化的病理必經過程，目前的研究認為肝纖維化是可逆的，而肝硬化是不可逆的。因此肝纖維化的早期診斷和及時干預對疾病的進展及預后的改善非常重要［7］。研究肝纖維化發展過程中各階段的病理變化，解釋其發生的機制，是進一步治療和預防肝硬化的重要措施。本研究顯示細胞的外基質沉積是導致肝纖維化發生的重要條件，而TGF－β1高表達在促進肝纖維化發生中起重要作用。因此在細胞外基質降解下降的纖維化中發生的TGF－β1 是最為重要的細胞因子［8］。

肝臟疾病在臨床上采用肝活檢病理診斷是診斷肝臟纖維化的客觀標準，但血清學診斷的指標是目前臨床常用的判斷和分析是否有HBV感染及患者病程的重要指標之一［9］，也成為目前研究肝臟疾病的焦點，研究認為，在肝纖維化發生過程中具有重要價值的指標有：HA、ALT、TGF等。大鼠血清ALT、HA、TGF－β1表達水平模型組與對照組相比具有顯著性差異，并且其表達量隨肝臟纖維化演進程度呈一致性。ALT、HA、TGF－β1三者在血清中的表達可以作為判斷肝臟纖維化程度的生物學指標。

本研究顯示，在肝纖維化形成和演進過程中，肝組織 TGF－β1、Smad3表達明顯增強，血清中ALT、HA、TGF－β1表達水平明顯升高，而肝臟組織中的Smad7表達顯著減低，TGFβ1／smad信號傳導通路功能明顯增強，這些改變對肝纖維化發生及發展都起到了十分顯著的重要作用，為臨床上防治肝臟纖維化和肝硬化提供了新的思路。但是TGFβ1／smad信號傳導通路中的調控機制，尚需要進一步深入研究。

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