新生代飼用酶實現“三贏”

文|本刊編輯部

新生代飼用酶實現“三贏”

文|本刊編輯部

在飼料添加劑中，酶制劑是由微生物發酵產生的天然、綠色、無污染、無殘留的生物制品。飼料用酶分子改良技術的研究與相關產品的創制。將更好地促進中國農業技術與國際接軌。

隨著現代化畜牧業的快速發展，飼料中添加抗生素在抗病、促生長的同時，也帶來細菌耐藥性增強的后果。如果使用不當，還會造成畜產品中的藥物殘留超標。目前，許多國家都在努力加大飼料添加劑的管理，歐盟、日本、美國等國家相繼頒布了一系列法律，在飼料中禁止或限制使用抗生素等藥物類飼料添加劑。我國農業部今年公布的“農業部第2292號公告”規定：自2016年12月31日起，停止經營、使用用于食品動物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種原料藥的各種鹽、酯及其各種制劑。

無疑，天然、綠色、無污染、無殘留成為全世界畜牧業發展的主題。

穩定性差是飼料酶制劑工業化中的一大難題

自從1975年美國飼料工業首次把酶制劑作為添加劑應用于配合飼料中并取得顯著效果后，飼用酶制劑日益受到世界養殖業的重視。

國內外學者研究和企業應用表明，酶制劑用于飼料，可以擴大飼料原料的來源，提高飼料原料的營養價值，調節動物機體免疫力，提高動物的免疫功能。通過降解單胃動物幾乎不能利用的一些多糖，從而提高了日糧的代謝能值，對粗蛋白的消化率亦有較明顯的提高。

目前國內外很多企業實現了飼料酶制劑的工業化，獲得了較高酶活力的菌株，但在粗放的工業條件下（如高溫、高壓、重金屬離子、氧化劑和極端pH值等），天然酶常會遭到破壞，使酶的生產和使用受到極大限制。當前工業上直接利用酶制劑時還存在一些缺點，如穩定性差、使用率低、不能在有機溶劑中使用、壽命不長等，造成了使用酶的成本升高。其中，酶的穩定性是現階段酶應用中的一大難題。

主攻性能和成本的開拓性研究

中國農業科學院飼料研究所姚斌研究團隊承擔的863計劃現代農業領域高技術項目“飼用酶的分子改良與產品創制”課題執行3年以來，取得了重要進展。

研究團隊在國內率先開展將基因工程等高新技術應用到傳統飼料行業這一開拓性的研究工作中去。

針對阻礙飼料用酶規模應用的兩大瓶頸性問題——酶的性能和生產成本，課題組確立了從酶的分子生物學基礎性科學問題入手、系統性解決問題的研究思路；建立了完整的酶基礎研究和產品開發技術體系，打破了國際大公司的壟斷，并使我國飼料用酶迅速發展成為具有國際競爭力、效益顯著的新興產業；確立了在學術研究和飼料高新技術實際應用上的領先地位，并起到示范作用。

同時，科研團隊還創建了飼料用酶及基因的高效克隆技術體系，獲得了百余個具有自主知識產權和應用價值的新型飼料用酶基因，突破了發達國家在飼料用酶資源方面的專利壁壘，使我國在飼料用酶基因資源的爭奪上處于國際制高點，奠定了我國飼料用酶的產業基礎。

不僅如此，在酶的構效機理研究方面也取得了新的突破，創新了酶蛋白分子改良技術體系；建立了酶蛋白分子的生物信息學分析平臺，分析酶蛋白或氨基酸的分子動力學，能量、表面電荷和分子鍵等的動態變化，用以對多種酶蛋白的結構、催化機制等特征與其重要理化特性（溫度、pH特性及抗逆性等）之間相互關系的分子機理進行研究；借助生物信息分析平臺，針對性地指導酶蛋白改良的理性設計，建立了以活性中心為核心、由面到點進行酶分子突變的新技術和方法，快速實現酶分子的“跳躍式進化”，獲得大量突變體；利用自主構建的木聚糖酶融合胞外表達載體等突變文庫篩選系統，結合應用微培養、熒光技術等高通量定向篩選技術，快速篩選獲得有效突變體。

該研究獲得了多種性質得到改良、可應用于實際生產的改良酶，滿足了飼料高溫制粒和動物消化生理的特殊要求，以及通過快速篩選技術與模擬胃腸道酶性能評估技術，快速評估酶的應用潛力并指導改良酶的篩選等一整套成熟易操作的酶蛋白分子改良與篩選技術，并利用該技術進行了葡萄糖氧化酶、真菌淀酶、脂肪酶、阿魏酸酯酶、非淀粉多糖酶等多種飼料用酶的分子改良，獲得了綜合性能優良的改良酶資源。

課題“高油高蛋白油料水酶法提油及其蛋白資源利用關鍵技術研究”中期檢查。

通過酶基因的優化，新促表達因子的挖掘利用，不同促表達因子的合理整合，受體菌株的改良等方法，闡明了酶表達機制上的一些關鍵問題，創建了表達量達到10克/升以上級的高效表達技術體系，系統解決了飼料用酶表達量低、生產成本高的問題，為飼料用酶的產業化生產和大規模應用提供了技術保障。

通過對團隊自己構建工程菌株在發酵罐水平反復工藝測試與摸索，快速有效地提高了工程菌株的發酵水平。葡萄糖氧化酶、真菌淀粉酶、脂肪酶3種在工程菌中的表達量為4500U/毫升（國內外的一般表達水平：＜500U/毫升）、3200U/毫升［國內外的一般表達水平：2000U/克（固體發酵）］、22000U/毫升（國內外的一般表達水平：＜10000U/毫升），表達量和催化效率遠優于國內外其他酶制劑水平。以飼料用葡萄糖氧化酶為例，該酶可在動物胃腸道中產生厭氧環境并形成具有殺菌作用的過氧化氫，殺滅有害細菌。由此，可作為抗生素的替代品應用，減少抗生素的使用，提高飼料利用率，保障動物產品安全。目前葡萄糖氧化酶因性能差、生產成本高的問題，還未在飼料工業中廣泛應用。

研究團隊從肉雞的腸道微生物中克隆篩選得到一個綜合性質較優良的葡萄糖氧化酶及其基因。該酶具有適合于在飼料中應用的綜合優良性質：最適溫度為40℃，在20～50℃下能維持90%以上的酶活性，在酸性和中性環境中能保持較高的活性；該酶還具有極好的抗蛋白酶能力，能夠抵御胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解作用。這些特性使其適合于在肉雞、蛋雞、豬及水產飼料中應用。

進一步構建了高效表達葡萄糖氧化酶的重組酵母，在其表達量達到12毫克/毫升發酵液，其效價達4000U/毫升，較國內外的報道和專利水平高20倍以上。同時，建立了生產葡萄糖氧化酶的高細胞密度發酵工藝、產品后加工工藝，酶在后加工過程中的回收率超過85%。該技術已完成中試和試生產，技術成熟，可進行產業化生產，整體達到國際領先水平。

除此之外，作為科技管理部門，中國農村技術開發中心在飼用酶的分子改良與產品創制項目的實施過程中也積累了豐富的組織實施和管理經驗，組建了一支高素質的團隊，更好地保障了項目的先進性和創新性。

“飼用酶的分子改良與產品創制”課題中期檢查。

突破壁壘，改良技術效益卓著

通過863計劃現代農業領域項目和其他國家課題的支持，近3年，研究團隊建立了有效的分子設計技術和篩選技術5項，申請并獲得發明專利20余項，發表研究論文40余篇，獲國家科學技術進步獎二等獎1項。

市場應用方面，酶蛋白分子改良技術體系技術成果得到了很好的推廣應用。經過3年的時間，利用該技術生產銷售單酶及復合酶產品超過20萬噸，在全國30多個省區上千家飼料及養殖企業推廣應用，并出口歐美等20余個國家。產品已廣泛應用于國內的豬、雞、水產等動物飼料，并節約飼料糧5000萬噸、磷資源1000萬噸，減少養殖業磷氮等有機物排放1300萬噸。

由于成功地將酶蛋白分子改良技術研究成果轉化到實際生產中去，目前國內飼料用酶制劑的價格明顯降低。利用飼料用酶技術生產的植酸酶產品占據了國內植酸酶市場份額的90%以上，60%以上的產品實現出口，國外產品基本退出中國市場。

此外，該技術的廣泛應用，提高了養殖動物對飼料的消化利用率，進而每年可節約飼料原料百萬噸以上，節省飼料成本數億元，并使動物糞便中排出的有機污染大量減少，實現了經濟效益、社會效益和生態效益“三贏”。