純化水微生物限度檢查方法優選

北京北大維信生物科技有限公司（100094）金寶華 姜琳 張麗梅 馬威

水在制藥工業中是應用最廣泛的工藝原料，用做藥品的成分、溶劑、稀釋劑等。水是良好的溶劑、尤其是與自然界失去平衡的純化水和注射用水，具有極強的溶解能力和極少的雜質，廣泛用于制藥設備和系統的清洗[1]。鑒于水在制藥工業中既作為原料又作為清洗劑，各國藥典對制藥用水的質量標準，都有明確的定義和要求；當前中國藥典（2010年版）、美國藥典（USP36-NF30）及歐洲藥典（7.0）中純化水微生物限度檢查方法均為薄膜過濾法，但是所用培養基、培養條件（溫度、時間）不同。為指導我廠在純化水日常監測及驗證微生物限度檢查法的選擇，對檢查方法進行優選驗證。

1 驗證項目

根據本驗證的三個主要目的，制定驗證項目，見附表1。

附表1 驗證項目表

2 驗證前準備

①人員培訓 質量管理部組織了驗證方案的培訓；受訓人掌握了方案內容；培訓有記錄。 ②驗證用工具及儀器設備 驗證用工具均清潔和滅菌。驗證用主要儀器、設備、儀表均經過校驗或驗證，并在有效期內。③驗證用培養基 按驗證方案中各方法要求制備所需培養基，培養基干粉均來自合格供應商并在有效期，且已經過計數培養基的適用性檢查合格。詳見附表2。④驗證用菌液制備 按方案中方法要求制備所需陽性菌液，詳見附表3。⑤驗證用純化水取樣 按我廠《制藥用水取樣操作程序》進行供試品的取樣。

附表2 驗證用培養基列表

附表3 驗證用菌液表

3 驗證過程

3.1 美國藥典、中國藥典與歐洲藥典純化水微生物檢查方法 美國藥典、歐洲藥典與中國藥典純化水微生物限度檢查方法均為薄膜過濾法，但是在培養基、培養溫度及培養時間方面有所區別，具體見附表4。

附表4 美國藥典、中國藥典與歐洲藥典純化水微生物限度檢查方法對比

3.2 驗證的操作環境

3.2.1 三方藥典檢查方法分析、最優的檢查方法計數方法的驗證在獨立的陽性潔凈區域的生物安全柜內進行操作。

3.2.2 中國藥典與經驗證的最優純化水微生物計數方法間差異分析實驗在10000級潔凈區域內100級超凈工作臺內進行。

3.3 驗證實施及結果

3.3.1 美國藥典、中國藥典與歐洲藥典純化水微生物檢查方法差異分析

3.3.1.1 三方藥典純化水微生物限度檢查方法差異分析概述 根據本文附表 4，美國藥典、中國藥典與歐洲藥典純化水微生物檢查方法的區別主要包括培養基種類、培養溫度和培養時間，概括起來有5種不同條件。為考察此5種純化水微生物檢查方法實際檢查能力之間的關系，擬使用常見微生物的典型菌株（附表 3）分別按檢查方法的5 種不同條件進行檢查，使用單因子方差分析的方法考察5種不同條件對各類微生物典型菌株檢查能力之間是否存在顯著性差異。

以純化水微生物檢查方法為因子（使用字母 A 表示），使用不同檢查方法（不同的因子水平，見附表5）獲得的微生物計數結果。

附表5 因子水平（Ai）與檢查方法對應關系

附表6 大腸埃希菌檢測結果列表

3.3.1.2 分析方法 方差分析（ANOVA）：又稱變異數分析或F檢驗，其目的是推斷兩組或多組資料的總體均數是否相同，檢驗兩個或多個樣本均數的差異是否有統計學意義。包括單因素方差分析即完全隨機設計或成組設計的方差分析和多因素方差分析。

Tukey多重比較：對檢驗數據使用方差分析評估統計差異外，還使用Tukey多重比較的實際差異性。Tukey多重比較指對于各種不同的比較樣本，給出聯合置信區間的方法，對不具有共同置信區間的樣本（組）進行判異。Tukey多重比較可以具體找出哪個單位測試數據超出了聯合置信區間。通常當且僅當置信區間中不包含零時，才會否定均值之間無差異的原假設。檢測數據的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數據之間具有顯著差異。

3.3.1.3 驗證數據 按3.3.1.1獲得的微生物計數結果服從正態分布，檢查結果之間相互獨立，其方差相等。通過方差分析考察不同方法對各類常見微生物典型菌株的檢查結果之間是否存在顯著性差異，進而判斷檢查方法之間是否存在顯著性差異。通過Tukey多重比較列表篩選無差異且檢出率較高的水平。以下各組均使用方差分析、Tukey多重比較2種方法評估差異性。

①革蘭氏陰性菌（大腸埃希菌，銅綠假單胞菌）檢測結果方差分析：革蘭氏陰性菌—大腸埃希菌檢測結果方差分析（見附表6、7）。在顯著性水平（α=0.05）上，P＜0.05，大腸埃希菌的5種檢驗方法有差異。再用Tukey 多重比較法進一步分析。使用 Tukey 方法和 95% 置信度對信息進行分組（見附表8）。檢測數據的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數據之間具有顯著差異。

附表7 大腸埃希菌檢測結果方差分析表

附表8 大腸埃希菌檢測結果Tukey 多重比較

②革蘭氏陰性菌—銅綠假單胞菌檢測結果方差分析（見附表9、10）。在顯著性水平（α=0.05）上，P ＜0.05，銅綠假單胞菌的5種檢驗方法有差異。再用Tukey多重比較法進一步分析。使用 Tukey 方法和 95% 置信度對信息進行分組（見附表11）。檢測數據的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數據之間具有顯著差異。

附表9 銅綠假單胞菌檢測結果列表

附表10 銅綠假單胞菌檢測結果方差分析表

附表11 銅綠假單胞菌檢測結果Tukey 多重比較

附表12 金黃色葡萄球菌檢測結果列表

③革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）檢測結果方差分析（見附表12、13）。在顯著性水平（α=0.05）上，P＜0.05，金黃色葡萄球菌的5種檢驗方法有差異。再用Tukey多重比較法進一步分析。使用 Tukey 方法和 95% 置信度對信息進行分組（見附表14）。檢測數據的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數據之間具有顯著差異。

附表13 黃色葡萄球菌檢測結果方差分析表

附表14 黃色葡萄球菌檢測結果Tukey 多重比較

④芽孢菌（枯草芽孢桿菌）檢測結果方差分析（見附表15、16）。在顯著性水平（α=0.05）上，P＜0.05，枯草芽孢桿菌的5種檢驗方法有差異。再用Tukey多重比較法進一步分析。使用 Tukey 方法和 95% 置信度對信息進行分組（見附表17）。

檢測數據的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數據之間具有顯著差異。

⑤酵母菌（白色念珠菌）檢測結果方差分析（見附表18、19）。在顯著性水平（α=0.05）上，P>0.05，白色念珠菌的5種檢驗方法無差異。再用Tukey 多重比較法進一步分析。使用 Tukey 方法和 95%置信度對信息進行分組（見附表20）。

附表15 枯草芽孢桿菌檢測結果列表

附表16 枯草芽孢桿菌檢測結果方差分析表

附表17 枯草芽孢桿菌檢測結果Tukey 多重比較

附表18 白色念珠菌檢測結果列表

附表19 白色念珠菌檢測結果方差分析表

附表20 白色念珠菌檢測結果Tukey 多重比較

檢測數據的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數據之間具有顯著差異。

⑥霉菌（黑曲霉）檢測結果方差分析（見附表21、22）。在顯著性水平（α=0.05）上，P>0.05，黑曲霉菌的5種檢驗方法無差異。也可再用Tukey 多重比較法進一步分析。使用 Tukey 方法和 95%置信度對信息進行分組（見附表23）。

檢測數據的差異性用“分組”表示，分組中不共享字母的因子的檢測數據之間具有顯著差異。

3.3.1.5驗證結論 在顯著性水平（α=0.5）上對不同水平檢驗結果進行方差分析，白色念珠菌、黑曲霉菌在A1～ A5水平不存在差異，其他4株（大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）均存在差異。

再使用Tukey多重比較法比較各水平的相互差異，列表篩選無差異且檢出率較高的水平見（見附表24）。

3.3.2 最優純化水微生物限度檢查方法計數方法的驗證。

QC于2014年6月19日、20日、22日，以C0041001 點（我廠純化水點編號，下同）純化水作為供試品，使用6種典型代表菌株，分別進行3次獨立平行試驗。

3.3.2.1 驗證方法試驗組：無菌操作，取10ml純化水樣品，加至已裝有100mlpH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的薄膜過濾器內， 再加入1ml含菌數50～100cfu/mL的菌液，過濾，濾干后取出濾膜菌面朝上貼于R2A瓊脂平板上。于30℃～35℃培養120小時，計數。

菌液組：分別取銅綠假單孢菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉驗證用菌液各1ml，加入含100mlpH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至濾器內，過濾，濾干后取出濾膜菌面朝上貼于R2A瓊脂平板上。于30℃～35℃培養120小時，計數。

供試品對照組：無菌操作，取10ml純化水樣品，加至已裝有100mlpH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的薄膜過濾器內，過濾，濾干后取出濾膜菌面朝上貼于R2A瓊脂平板上。于30℃～35℃培養120小時，計數。

稀釋劑對照組：使用 pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替試驗組中的純化水樣品按試驗組操作進行檢查計數。

回收率計算結果見附表25。

3.3.2.2 結果 計算公式見附圖；計算結果見附表26。

3.3.2.3 結論 在純化水微生物限度檢查最優檢查法（歐洲藥典方法）的驗證試驗中，6種試驗菌株的回收率均達到70%以上，證實該方法適用于純化水的微生物限度檢查。

3.3.3 中國藥典與經驗證的最優純化水微生物計數方法間檢測結果差異分析 QC于2014年6月30日至7月11日， 連續10個工作日同時使用最優檢測方法（歐洲藥典方法）與中國藥典檢測方法對純化水系統的送水口（C0041002 ）實施同步持續檢測，獲取 10 組檢測數據，對檢測數據進行統計分析，評估。

附表21 黑曲霉檢測結果列表

附表22 黑曲霉檢測結果方差分析表

附表23 黑曲霉檢測結果Tukey 多重比較

附表24 檢測方法的Tukey 多重比較法優選表

附表25 計數方法驗證的回收率列表

附表26 中國藥典方法、歐洲藥典方法檢驗結果列表

附表27 中國藥典方法、歐洲藥典方法檢驗結果方差分析表

附圖 計算公式

3.3.3.1 驗證方法 無菌操作，取10ml純化水樣品，加至已裝有100mlpH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的薄膜過濾器內，過濾，濾干后取濾膜貼于適當的瓊脂平板上，培養，檢查計數。

3.3.3.2 結果 使用單因子方差分析，不同檢測方法為不同水平，設：B1——經驗證的中國藥典方法，B2——經驗證的最優檢測方法（歐洲藥典方法），根據實驗數據，計算 F 比。比較2種方法的差異水平。2種方法的10次檢驗結果見附表26；方差分析結果見附表27。

3.3.3.3 結論 驗證結果表明，在顯著性水平α = 0.05上，P>0.05，2種檢驗方法無差異。

4 驗證總結論

4.1 通過在顯著性水平（α=0.5）上對不同水平檢驗結果進行方差分析，再使用Tukey 配對比較法比較各水平的相互差異，列表篩選無差異且檢出率較高的水平為歐洲藥典方法。

4.2 對選出的最優純化水微生物限度檢查方法（歐洲藥典方法）進行計數方法驗證，6種試驗菌株的回收率均達到70%以上，證實該方法適用于純化水的微生物限度檢查。

4.3 通過對最優純化水微生物限度檢查方法（歐洲藥典方法）與現行經驗證的中國藥典方法的比較分析，證實2種檢驗方法無統計學差異。

對優選的方法是否可替代我公司正在使用并經過計數方法驗證的中國藥典方法，還需按照《中華人民共和國藥典（2010年版）》第一部 附錄XVIII E藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則 “樣品中微生物定量檢驗方法的驗證”進行進一步驗證。