不同加樣方式對ELISA競爭法檢測乙肝核心抗體的影響

俞勝琴

（江寧區第二人民醫院檢驗科，江蘇 南京 211100）

不同加樣方式對ELISA競爭法檢測乙肝核心抗體的影響

俞勝琴

（江寧區第二人民醫院檢驗科，江蘇 南京 211100）

目的 探討不同加樣方式對酶聯免疫吸附試驗競爭法檢測乙肝核心抗體結果的影響。方法 收集132例門診和住院患者血清樣本，運用ELISA競爭抑制法，按照3種不同的加樣方式檢測乙肝核心抗體進行對照。結果 加樣方式1的陽性率為12.12%；加樣方式2的陽性率為14.39%；加樣方式3的陽性率為28.78%。三種不同的加樣方式，陽性檢出率各不相同。結論 三種不同的加樣方式對ELISA競爭法檢測乙肝核心抗體的檢測結果不同。加樣方式1是標準的加樣方式，準確性高；加樣方式2與加樣方式1相比較無統計學意義，結果無明顯差異；加樣方式3與加樣方式1相比較有統計學意義，結果有明顯差異。

酶聯免疫吸附試驗；競爭法；乙肝核心抗體；陽性檢出率

乙型肝炎核心抗體是乙肝病毒感染的指標，它的出現提示機體正在感染或既往感染過乙肝病毒。因此，乙肝核心抗體的檢測在乙型肝炎的診治方面具有十分重要的作用[1-2]。ELISA法檢測乙肝病毒核心抗體已成為應用最廣泛的免疫檢測技術。ELISA競爭法是檢測乙肝病毒核心抗體的常用方法，在臨床實驗室中廣泛應用。本文運用ELISA競爭法檢測132例門診及住院患者乙肝核心抗體為例，以不同的加樣方式對ELISA競爭法的影響進行實驗和評價，分析其對乙肝核心抗體陽性檢出率的差異。

1　材料與方法

1.1標本：隨機抽取2014年4～6月，132例門診和住院患者血清樣本，清晨空腹采集患者的靜脈血5 mL，患者年齡段為22～50歲，平均38歲；標本無溶血、脂血、黃疸等。

1.2試劑及儀器：核心抗體ELISA競爭抑制法檢測試劑盒，產家由北京萬泰藥業股份有限公司提供，酶標儀（KHB KT-360）和洗板機（KHB KT-36W）均由上海科華實驗系統有限公司提供。

1.3方法

1.3.1采血2 h后，離心分離血清，2～8 ℃冰箱保存，48 h內完成測試。

1.3.2加樣方式1：用可調加樣器調至100 μL，吸取100 μL血清放入試管底部，用吸管取0.9%氯化鈉3 mL混勻（1∶30倍稀釋）。每板設陰性對照3孔，陽性對照2孔，空白對照1孔，微孔按序編號。分別在相應孔中加入待測樣品及陰、陽對照各50 μL，空拍孔不加；加樣方式2：血清不稀釋，每孔直接加入血清10 μL，各設陰、陽及空白對照；加樣方式3：血清不稀釋，每孔直接加入血清50 μL，各設陰、陽及空白對照[3]。

1.3.3加酶：每孔均加入酶標試劑50 μL，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后置37 ℃，溫育30 min。小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干[4]。每孔加入顯色劑A、B液各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻，10 min內用酶標儀在450 nm波長處，用空白孔調零點后測定各孔A值。

1.3.4統計：進行統計學處理，通過χ2檢驗，P＞0.01，無統計學意義；P＜0.01，有統計學意義。

2　結 果

2.1實驗結果：“加樣方式1的陽性率為12.12%；加樣方式2的陽性率為14.39%；加樣方式3的陽性率為28.78%。”

2.2三種不同加樣方式檢測132例乙肝核心抗體結果分析：見表1、2。

表1　方法2與方法1檢測乙肝核抗體結果比較

表2　方法3與方法1檢測乙肝核抗體結果比較

3　討 論

ELISA競爭抑制法的原理，是將抗原包被反應板，加入待檢標本與酶標液的單克隆抗體二者競爭結合固相抗原，即酶標抗體和標本抗體在同樣的反應體系中與固相抗原等比競爭結合，溫育后洗滌加入顯色劑，顯色的強弱與待檢標本中抗體的含量成反比[5]。ELISA競爭法是檢測乙肝核心抗體實驗簡單、實用、實驗要求條件低、易于操作，是被臨床廣泛應用的經典實驗。以上實驗可以說明：

3.1三種不同的加樣方式運用ELISA競爭抑制法的原理對乙肝病毒核心抗體進行檢測，加樣方式不同，檢出的陽性率也有差異。

3.2加樣方式1操作流程較復雜，血清標本要經過1∶30倍的稀釋。稀釋時，每人需要一支試管，當樣本量大時，會造成一定的人力、物力的浪費。但此加樣方式準確性高，臨床可靠，是標準的加樣方式，公認的檢測方法。

3.3加樣方式2是直接加入血清10 μL，其加樣方式和標準加樣方式1二者檢測的結果，經過統計學分析與比較：χ2=0.16，0.5＜P＜0.75，P＞α=0.05，乙肝病毒核心抗體陽性率無明顯差異，變化不顯著。此法雖不是標準的加樣方式，當進行大規模的體檢時，即檢測的樣本量很大時，運用此法，省去了加樣方式1的血清標本1∶30倍稀釋的繁瑣程序，在一定程度上具有操作簡單、省時、經濟、環保的特點，提高了工作效率。

3.4加樣方式3是直接加入血清50 μL。實驗表明，與標準的加樣方式1相比較：χ2=11，P＜0.005，P＜α=0.05。兩方法的結果有統計學意義，乙肝病毒核心抗體的陽性率明顯上升，差異顯著。導致此結果可能是以下幾個方面的原因：①當直接加入50μL血清標本時，乙肝病毒核心抗體的酶標抗體-HBc與反應板上包被的固相抗原HBcAg結合機會有所減少，從而嚴重影響結果的檢測；②抗原與抗體的特異性結合，是有一定的比例性，當比例不匹配時，會出現帶現象。即抗體過量時，出現前帶現象；抗原過量時，出現后帶現象。本試驗，是由于加入了過量的抗體，故出現了前帶現象；③有研究報道未稀釋或低倍稀釋存在較高的非特異反應；單項乙肝病毒核心抗體陽性標本中存在低滴變和假陽性結果[6]。由于上述原因常常會導致假陽性的出現，使得陽性率明顯增高。所以，加樣方式3不適合用ELISA競爭抑制法檢測乙肝病毒核心抗體標志物。

3.5當然，影響ELISA競爭抑制法的因素還有很多很多。在日常的實際操作中，除上述加樣方式外，還有加樣的間隔時間長短[7]、標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存過間過長和標本凝固不完全、試劑盒的抗原不純等等都可導致假陽性，影響實驗室檢測結果的準確性[8-9]。

因此，在ELISA法驗測乙肝病毒核心抗體標志物時，若一般門診及住院患者數量不是很大時建議采用加樣方式1；遇有大規模普查或體檢情況等大量標本時若采用加樣方式1，其工作量太大，同時也增加了操作的繁瑣性，建議采用加樣方式2；原則上在ELISA法檢測乙肝病毒核心抗體時，不采取加樣方式3的方式。同時，我們在實際操作過程中，還應對標本進行嚴格處理，選擇靈敏度高、特異性強的試劑和具有準確、穩定的酶標儀，開展室內質控等辦法與舉措，才能保證檢驗結果準確無誤，更好地為患者及臨床服務[10]。

[1] 張麗莉,蔡安.三種不同加樣模式對ELISA法檢測乙型肝炎核心抗體結果的影響[J].實驗與檢驗醫學,2010,28(6):645.

[2] 胡建平.不同加樣方式對酶聯免疫吸附試驗檢測抗-HBc的影響[J].臨床誤診誤治,2011,24(6):81-82.

[3] 梁修珍.6種不同加樣量對酶聯免疫測定法檢測乙型肝炎病毒核心抗體結果的影響[J].國際檢驗醫學雜志,2014,35(4):481-482.

[4] 鄒映東,林云,張興宗,等.不同稀釋及洗板方式對競爭法檢測乙肝核心抗體的影響[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(12):1569-1570.

[5] 王蘭蘭,吳健民.臨床免疫學與檢驗[M].4版.北京:人民衛生出版權社,2010:103-107.

[6] 李艷霞.ELISA法檢測乙肝病毒抗-HBc和抗-HBe假陽性原因分析[J].中國當代醫藥:2010,17(36):82-84.

[7] 何瑛,吳人風.加樣時差對競爭法抑制法檢測抗-HBc的影響因素探討[J].中國當代醫藥,2010,17(10):56-57.

[8] 楊京民.ELISA法對乙型肝炎“兩對半”檢測結果的影響因素的分析[J].國際檢驗醫學雜志,2012,32(21):2551-2552.

[9] 丁文,薛慶歡,吳文金,等.人為操作因素對酶聯免疫吸附法檢測乙肝病毒血清標志物影響的探討[J].中國實驗診斷學,2010,14 (7):1019-1022.

[10] 薛春梅,鄒建波.ELISA法乙肝兩對半檢測影響因素分析和臨床意義[J].中國誤診學雜志,2011,11(16):3913-3914.

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1671-8194（2015）30-0145-02