中藥材對黃曲霉毒素B1快速檢測的影響

北京市藥品檢驗所（100035）李輝

黃曲霉毒素（Aflations，簡稱AFs）是食品和藥用植物中最為常見霉菌毒素黃曲霉（Aspergillus. favus）和寄生曲霉菌（Aspergillus. parasiticus）的次級代謝產(chǎn)物[1]。其污染范圍廣泛，存在于花生、玉米、小麥以及中藥材等產(chǎn)品中。AFs的基本結構為二呋喃環(huán)和香豆素，黃曲霉毒素B1（AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰酮的衍生物，含有一個雙呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰酮（香豆素），前者為基本有毒性成分結構，后者屬于引起致癌性作用的有效基團[2]。AFB1是一種劇毒和強致癌性物質，主要作用的靶器官是肝臟，能夠引起慢性肝炎、肝壞死及肝硬化等肝臟疾病[3]。

目前，已有檢測AFs含量的方法主要分為下列幾種，一類是以色譜技術為基礎的理化檢測方法，即生物鑒定法和儀器檢測法[4]。儀器檢測法包括薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等；另一類是應用免疫層析技術的化學檢測方法，包括放射免疫法（RIA）、免疫親和柱法（IAC）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以及試紙條法等。由于常規(guī)儀器分析技術不能滿足毒素快速篩查目標，試紙條檢測法應運而生。但是，中藥材自身化學組分復雜，基質干擾大，常對試紙條檢測結果造成假陽性的干擾。因此，本文以蓮子、當歸、山楂、麥芽及大黃為研究對象，初步探討試紙條檢測技術在中藥中AFB1快速檢測應用及影響因素，為建立中藥中AFB1快速檢測方法提供參考。

1 膠體金免疫層析技術在中藥材真菌毒素檢測中的應用

膠體金免疫層析技術是20世紀80年代繼熒光素標記技術、放射性同位素標記技術及酶標記之后發(fā)展起來一種固相快速免疫診斷技術[5]。該技術利用金納米顆粒作為示蹤物，以抗原結合抗體表現(xiàn)出的直觀顏色變化來判定樣品中是否含有抗原，從而達到檢測目的。

目前，膠體金免疫層析技術以其高特異性、高靈敏性、方便快速檢測應用于食品、藥品等快速檢測中[6]。但是，應用此技術用于檢測中藥中的真菌毒素研究尚未報道。大多由于中藥自身化學成分復雜、基質干擾較大并需要繁瑣的前處理條件，以至于研究者很少關注中藥材真菌毒素快速檢測。隨著中藥的國際化，中藥出口的問題化也越來越嚴重，中藥“治病”和“產(chǎn)病”一直是大家關心的話題。大量研究表明中藥材易被真菌毒素（如：黃曲霉毒素，赭曲霉毒素等）污染[7]。所以，建立一種快速便捷的中藥材真菌毒素檢測方法勢在必行。膠體金免疫層析技術應用的范圍越來越廣泛，今后，利用膠體金免疫層析技術檢測中藥材中真菌毒素將是篩查真菌毒素污染的最好方法。

2 試紙條法對中藥材選取影響

中藥材中可能存在的外源性污染主要包括真菌毒素殘留、農藥殘留、重金屬及有害元素殘留等[8]。中藥中的有害殘留物主要來自于藥用植物在生長過程中接觸的土壤、水、大氣等自然環(huán)境和炮制、加工、運輸、貯藏等過程中的污染。為了監(jiān)測和控制真菌毒素的污染，同時保障人類的身體健康。簡單、靈敏、準確、快速、經(jīng)濟的真菌毒素分析方法的建立是近年的研究重點和熱點。

由于，中藥材所含化學成分種類多，基質復雜，而真菌毒素的分析又屬于痕量分析，大大增加了檢測難度。而膠體金免疫層析技術是金顆粒作為標記物，以特異性的抗原和抗體結合反應而表現(xiàn)出的顏色變化，來判定檢測結果的，待測物結構與最終制備的試紙條靈敏度關系甚大。中藥材中不乏有些化學成分與AFB1的結構相似，常常會造成檢測結果的假陽性。為避免假陽性事件的發(fā)生，選擇合適的中藥至關重要。

另一方面，我國藥用植物資源豐富，臨床常用的預防治療疾病的植物多達700多種，不可能把所有中藥都作為研究對象。因此，優(yōu)選常見大宗藥材作為前期研究對象可為今后建立其他中藥中AFB1快速篩查提供依據(jù)。

2.1 中藥藥用功效研究 選取即可藥用又可日常保健的中藥作為研究對象，這類中藥兼具保健、食補、強身、健體多重功效，現(xiàn)實生活使用頻率較高。選取此類中藥不僅可以提高中藥品質，也能夠保障人類身體用藥安全[9][10][11][12]13]。同時，對補充和完善中藥AFB1快速檢測方法非常必要。本文以蓮子、當歸、山楂、麥芽及大黃為研究對象，其性效用見附表1。

附表1 5種中藥藥性效用分析

附表2 選取的5種中藥化學成分分析

附表3 中藥的基質效應考察

2.2 中藥的化學成分研究 在選取中藥時，化學結構對中藥中黃曲霉毒素B1的快速篩查的影響大。由于AFB1結構含有香豆素類成分，所以，應用膠體金免疫層析試紙條會對含有香豆素類成分的中藥檢測的假陽性出現(xiàn)率高。5種中藥所含的化學成分見附表2?？梢钥闯?，中藥化學組分中不含有香豆素類成分，可能對試紙條檢測結果假陽性率影響較小。

2.3 中藥的基質效應考察 中藥材基質效應是造成試紙條檢測假陽性重要原因，同時，基質效應簡單的藥材對制備的試紙條前處理液有良好的適應性。考察選取的5種中藥的基質效應影響。具體實驗步驟如下。

①將藥材粉碎，過40目篩，精密稱取供試品粉末2g，加入10mL甲醇-水（80:20，v/v），浸泡20min，渦旋振蕩10min，5000rpm離心5min；②精密吸取500μL上清液經(jīng)N2吹干，配制成低、中、高三個濃度水平的加標溶液，其中AFB1的加標水平為1，5，25ng/mL，將制得樣品液；③采用UPLC-MS/MS進行分析檢測，每個濃度2份，每份樣品重復測定3次；再用色譜甲醇配制相同濃度的標準品溶液，每個濃度2份，進樣分析，按照以下公式基質效應（ME%）=（加標樣品峰面積/標品峰面積）×100%[14]計算兩組峰面積的比值，分別考察5種藥材的基質效應，結果見附表3。中藥材的基質效應影響小，藥材中AFB1經(jīng)一步提取法檢測時受基質效應的影響越小。簡單的樣品檢測液也能保證在制備的試紙條上順利地完成檢測過程。

3 討論

AFB1是由黃曲霉菌和寄生曲霉產(chǎn)生的刺激代謝產(chǎn)物，為有害致癌性物質。其化學性質穩(wěn)定，不易被分解，毒性強，可通過食物鏈在生物體內轉移并蓄積。不斷堆積的AFB1不僅給農作物生產(chǎn)帶來巨大損失，而且嚴重危害人類的身體健康。隨著，中藥材國際化進程的加快，中藥的質量安全和品質保證成為關注的熱點話題。為保障人類健康不受危害，需要通過一種快速檢測的手段對真菌毒素進行初步篩查。膠體金免疫層析技術以其快速、靈敏、便捷、穩(wěn)定、操作簡便等特點受到廣泛的重視。

由于免疫層析技術并沒有在中藥檢測方面得到廣泛地應用。因此，在中藥材作為檢測研究對象時，一般需要遵循以下原則：①選取常見大宗中藥中易污染黃曲霉毒素的中藥作為研究對象。②剔除化學成分上與AFB1結構相似的中藥，如理化結構中含有香豆素類成分不作為本次實驗的研究品種。③選取即可藥用又可日常保健的中藥作為研究對象，這類中藥多具保健、食補、強身、健體多重功效，現(xiàn)實生活使用頻率較高。選取這類藥物不僅可以提高中藥品質，而且，能夠保障人類身體用藥安全。