細菌內毒素檢查法及其在藥品檢驗中的應用

田祥學

（黃岡市食品藥品監督檢驗中心，湖北 黃岡 438000）

細菌內毒素檢查法及其在藥品檢驗中的應用

田祥學

（黃岡市食品藥品監督檢驗中心，湖北 黃岡 438000）

注射用藥品對于熱原質的檢查傳統方法是家兔法。細菌內毒素檢查法相對于傳統方法有靈敏度高、操作簡便等諸多優點。鱟試驗法檢測細菌內毒素的技術，由于其快捷、靈敏、經濟、可標準化等優點可帶來良好的經濟及社會效益，中、美、英、日等國的藥典均有收載，是現行常用的細菌內毒素檢查法之一。

細菌內毒素；藥品檢驗；鱟試驗法

1　基本原理

細菌內毒素，英文稱作Endotoxin，是革蘭陰性菌細胞壁個層上的特有結構，內毒素為外源性致熱原，它可激活中性粒細胞等，使之釋放出一種內源性熱原質，作用于體溫調節中樞引起發熱。靜脈注射用藥品所含細菌內毒素超過一定的濃度會使人體體溫升高發生熱原反應，對用藥安全產生影響。鱟試驗法檢查細菌內毒素是美國科學家Levin和Bang1968年所建立的［1］。研究表明，細菌內毒素可以激活鱟試劑中鱟血細胞溶解物一系列凝集酶的反應，形成肉眼可見的凝固蛋白凝膠。利用這一原理用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定。

2　細菌內毒素檢查法

2.1內毒素標準品：細菌內毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制而成，用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度和標定細菌內毒素工作標準品效價。細菌內毒素的量用內毒素單位（EU）表示，1EU與1個內毒素國際單位（IU）相當。細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用于試驗中的鱟試劑靈敏度復核、干擾試驗及各種陽性對照。每1ng工作標準品效價應不小于2EU，不大于50EU，并具備均一性和穩定性的實驗數據。

2.2實驗準備：將玻璃器皿放入酪酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗劑中充分浸泡［2］，然后控干洗液，用蒸餾水沖洗3遍以上；置入干燥箱，在250 ℃干烤30 min以上，以除去可能存在的外源性內毒素的干擾。

2.3鱟試劑靈敏度復核：根據鱟試劑靈敏度的標示值（λ），利用漩渦混合器將細菌內毒素標準品與專門的檢查水混合溶解15 min，逐級2倍稀釋，并計算鱟試劑靈敏度測定值（λC）。靈敏度檢驗復核嚴格執行于每批新的鱟試劑。此外稀釋倍數加大的試劑可進行不干擾試驗可以排除干擾因素的影響。

2.4實驗方法：取4支試管，分別加入鱟試劑0.1 mL，再分別加細菌內毒素檢查用水0.1 mL溶解。其中2支加入按最大稀釋倍數稀釋的供試品溶液0.1 mL作為供試品管，1支加入2λ內毒素工作標準品溶液0.1 mL作為陽性對照管，1支加入細菌內毒素檢查用水0.1 mL作為陰性對照管。將試管混勻封口后置于（37±1） ℃水浴保溫1 h［2］。取出慢慢倒轉180°觀察，若管內凝膠附著管壁無明顯改變記為陽性（+），否則記為陰性（-）。供試品兩管均為（-），應認為符合規定。

2.5實驗中的注意事項：實驗前需用肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒［2］；移液管取樣時要注意防止氣體混入；反應過程中避免試管震動，以免凝膠破碎造成假陰性結果；靈敏度復核及干擾試驗時兩組應同時進行；實驗操作應該在清潔環境中進行，防止微生物污染。

3　與傳統方法對比

我們從方法的用時，操作難度、成本、靈敏度及標準化難度幾個方面與傳統家兔法進行對比，不難看出它的優點。見表1。

表1　鱟試劑法與家兔法對比

4　細菌內毒素檢查法的應用

1980年美國藥典最先收載了凝膠法，并作為仲裁法分別應用美歐日等多國的藥品檢驗。隨后動態濁度法、顯色基質法、電泳法、酶聯免疫等應用有了較快的發展，其優點在于降低了無關干擾且檢查速度較快。方法的自動化在不斷發展，動態顯色基質法和動態濁度法已實現儀器自動化檢測并進行數據處理，美國LAL4000、日本的Toxinometer201以及我國的BET-32型細菌內毒素測定儀［3］相繼出臺。另外，細菌內毒素檢驗梭魚的試劑量及樣品量要求在不斷降低，如酶聯免疫吸附法，所需的鱟試劑只需要凝膠法的百分之一，且具有更好的靈敏度和抗干擾能力［4］。

我國1991年首次收入部頒標準，1995年正式收載于中國藥典二部附錄，近20年來每版藥典收載細菌內毒素檢查的藥品都在成倍增長，中、美藥典收載品種情況見表2。

表2　中、美藥典收載細菌內毒素檢查數量情況對比

從對比情況來看，我國現行藥典收載品種數已經接近美國藥典25版水平。同時在藥品生產的質量控制和藥品檢驗中已廣泛應用于化學制劑、抗生素、原料藥及生物制劑，對中藥注射用的應用研究也在進行之中。

5　影響發展的因素與對策

不同藥物具有不同的特性，細菌內毒素檢驗法在藥品檢驗中有明顯局限性。在藥品檢驗過程中不僅要對每類藥品的各自特性進行全面分析，還要對藥品的每種成分進行毒性試驗，對于不同藥品的相互作用進行檢驗；隨著藥品種類的不斷增多以及藥品藥效的差異性增大，對于藥品檢驗技術的要求也日益增高。細菌內毒素檢查法在實驗的具體操作中必須盡量避免雜菌的干擾，然而實際操作中很難做到。因此需要對檢驗技術進行不斷改進。要加強培養優秀的檢驗技術人，要探索比凝膠法更全面的檢驗方法，加強相關研究，并及時更新檢驗設備，提高方法的應用價值。

6　總 結

細菌內毒素檢查法已被多國藥典收載，通過方法學驗證，越來越多的藥品采用這種方法取代傳統的家兔法，我國藥典自2000年版以來不斷增加細菌內毒素檢查的品種，2010年版藥典還對用于無菌分裝靜脈用注射劑的原料藥增加了細菌內毒素的控制，同時還擴展到了生物制劑的應用。目前國外細菌內毒素定量法的使用率達到65%以上，超過了凝膠法，與國外相比還存在一定的差距。隨著我國經濟的快速發展，技術研究的不斷深入，檢驗檢測儀器設備的更新換代，以及廣大醫藥工作不懈努力，相信細菌內毒素檢查法的在藥品檢驗中的應用領域與檢驗技術將得到更加廣泛的發展，不久將趕超世界先進水平。

［1］肖貴南，孫清萍，盛英美，等.如何建立新藥的細菌內毒素檢查方法［J］.中國醫藥導報，2011，8（32）:159-160.

［2］中國藥品檢驗標準操作規程［S］.2010.

［3］唐先明，何志一，劉建輝，等.熱原檢查用兔細菌內毒素敏感性研究［J］.黑龍江醫藥，2014，27（1）:1052-1055.

［4］孫哲.細菌內毒素檢驗［J］.世界最新醫學信息文摘（電子版），2012，（9）:128.

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1671-8194（2015）23-0278-02