黃柏藥材中生物堿類多成分的含量測定

張慶明，張平，徐云燕，蘇華

（中國人民解放軍南京軍區南京總醫院制劑科，江蘇南京210002）

黃柏藥材中生物堿類多成分的含量測定

張慶明，張平，徐云燕，蘇華

（中國人民解放軍南京軍區南京總醫院制劑科，江蘇南京210002）

目的建立同時測定黃柏藥材生物堿類多成分含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法。方法色譜柱為Waters XBridge C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為0.1%磷酸水（含0.02mol/L磷酸二氫鈉）-乙腈（3∶1）等度洗脫，流速為1mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為345 nm。結果生物堿類成分進樣量鹽酸小檗堿在0.880 0～13.200 0μg（n=6），鹽酸巴馬汀在0.003 8～0.060 8μg（n=6），鹽酸藥根堿在0.003 2～0.051 2μg（n=6）范圍內與峰面積線性關系良好；三者平均加樣回收率分別為96.23%，98.32%，96.44%，RSD分別為0.38%，0.56%，1.15%（n=6）。結論該法能同時測定黃柏藥材中小檗堿、巴馬汀、藥根堿生物堿類成分的含量，可有效控制黃柏藥材的質量。

高效液相色譜法；黃柏；生物堿類；鹽酸藥根堿；鹽酸巴馬??；鹽酸小檗堿

黃柏為常用中藥材，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效，習稱川黃柏，為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinese Schneid.的干燥根皮［1］。黃柏所含活性生物堿成分主要有小檗堿、藥根堿、巴馬?。?-3］，但黃柏藥材及含黃柏中藥復方制劑的質量均僅以小檗堿的含量作為評價指標。由于小檗屬多種植物中均富含上述成分，故上述方法難以有效控制黃柏藥材的質量。為客觀評價和控制黃柏的質量，本研究中建立了同時測定黃柏中小檗堿、巴馬汀、藥根堿生物堿類3種成分的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，現報道如下。

1 儀器與試藥

2695型高效液相色譜儀，包括2998型二極管陳列檢測器，Empower工作站（美國Waters公司）；LC-20A型液相色譜儀，包括Sartorius BT125D型；EPED超純水系統（日本島津公司）。鹽酸小檗堿（批號為110713-200609）、鹽酸藥根堿（批號為110732-200506）、鹽酸巴馬汀（批號為0733-200005）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈為色譜純，水為超純去離子水，其余試劑均為分析純；7批不同產地黃柏樣品由江蘇省中藥研究院生藥室采集，經鑒定為原植物為Phellodendron chinese Schneid.。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸水（含0.02mol/L磷酸二氫鈉）-乙腈（3∶1），等度洗脫；柱溫：30℃；檢測波長：345 nm。色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對照品適量，加甲醇溶解并定容，分別制成含0.90 g/L鹽酸小檗堿、0.20 g/L鹽酸藥根堿、0.15 g/L鹽酸巴馬汀對照品貯備液。取干燥黃柏樣品粉末（過3號篩）約0.4 g，精密稱定，置100mL容量瓶中，加入80mL 60%乙醇，超聲處理45min，冷卻，60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置，過濾，取續濾液過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密移取鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對照品貯備液1～50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成鹽酸藥根堿含量為0.003 8 g/L、鹽酸巴馬汀為0.003 2 g/L的混合對照品溶液，搖勻靜置，在擬訂色譜條件下分別進樣1，2，4，8，16，20μL，以峰面積積分值（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標制作標準曲線。取鹽酸小檗堿貯備液，在擬訂色譜條件下進樣1，3，7，10，15，20μL，以峰面積積分值（Y）為縱坐標、進樣量（X，mg）為橫坐標制作標準曲線。得回歸方程及線性范圍見表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 3種成分回歸方程及線性范圍（n=6）

精密度試驗：分別精密移取鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸巴馬汀對照品貯備液2mL，置10mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置。在擬訂色譜條件下進樣8μL，重復6次。結果的RSD分別為0.30%，0.35%，0.45%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取5份同批次黃柏樣品粉末0.4 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件進樣8μL測定。結果的RSD分別為1.50%，1.70%，1.83%（n=5），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0，3，8，24 h時進樣8μL測定。結果的RSD分別為1.51%，1.64%，0.53%（n=4），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：取5份已知含量的同一批次黃柏樣品約0.1，0.2，0.2 g，精密稱定，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品貯備液4mL，鹽酸藥根堿對照品貯備液300μL，鹽酸藥根堿對照品貯備液150μL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣8μL測定，結果見表2。

2.4 樣品含量測定

稱取各批次樣品0.4 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別精密吸取8μL，注入液相色譜儀，以外標法計算黃柏中3種成分含量，結果見表3。

表2 鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿及鹽酸巴馬汀加樣回收試驗結果（n=6）

表3 不同產地黃柏中3種成分含量測定結果（mg/g，n=3）

3 討論

提取溶劑的選擇：考察了甲醇、乙腈（V/V）、60%乙醇3種提取溶劑的提取效果。峰面積測定結果表明，60%乙醇對小檗堿、巴馬汀、藥根堿的提取效果明顯優于甲醇及乙腈，最終采用60%乙醇作為提取溶劑。

提取方法的選擇：考察了超聲提取、加熱回流提取和索氏提取3種提取方法。結果超聲提取45min的樣品各峰面積均大于加熱回流提取1，2，3 h的樣品峰面積，而索氏回流提取8 h的提取效果并未明顯高于超聲提取，最終選擇超聲提取45min。

流動相條件的考察：在水相為純水的條件下，各峰不能得到良好的分離且峰形拖尾嚴重，將水相條件調整為0.1%（V/V）磷酸溶液后，各峰峰形有明顯改善，但分離效果仍不理想。在0.1%（V/V）磷酸溶液中加入磷酸二氫鈉適量，配制成0.02mol/L的磷酸二氫鈉緩沖溶液后，各峰分離度均大于1.5，達到分離要求。

方法學考察及7批黃柏樣品中3種成分的含量測定結果表明，該法穩定、簡便、實用性強，為黃柏藥材的質量控制提供了較好的依據。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：214.

［2］肖培根.新編中藥志［M］.北京：化學工業出版社，2002：664-670.

［3］李峰，賈彥竹.黃柏的臨床藥理作用［J］.中醫藥臨床雜志，2004，16（2）：191.

R284.1；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0082-02

張慶明，男，在讀碩士研究生，助理工程師，執業藥師，（電子信箱）zhangqingming025@163.com；蘇華，女，碩士研究生，主管藥師，執業藥師，本文通訊作者，（電子信箱）suhuash@ sina.com.cn。

2014-12-29；

2015-05-30）