CaMKⅡ-p38通路在異丙酚誘導神經干細胞凋亡中的作用

王洪梅

（重慶市腫瘤研究所，重慶400030）

CaMKⅡ-p38通路在異丙酚誘導神經干細胞凋亡中的作用

王洪梅

（重慶市腫瘤研究所，重慶400030）

目的分析不同濃度異丙酚對神經干細胞凋亡的影響及CaMKⅡ-p38通路在其中的作用。方法取孕14 d大鼠分離胚胎神經干細胞，分為異丙酚低、中、高濃度組（A1，A2，A3組），對照組（B組）及溶劑組（C組），A1，A2，A3組分別給予質量濃度2.5，5.0及10.0μg/mL異丙酚處理，B組不作處理，C組給予脂肪乳替代異丙酚，分析各組細胞增殖及凋亡情況，Western Blot法分析CaMKⅡ及p38的表達情況。結果A組處理12 h后細胞增殖率無顯著性差異（P＞0.05），處理48，72 h后呈現出濃度和時間依賴性；與B組相比，C組細胞凋亡率與死亡率無顯著性差異（P＞0.05），A1，A2，A3組凋亡率和死亡率顯著升高（P＜0.05），且呈現劑量依賴性；隨著異丙酚處理濃度的提高，P-p38及P-CaMKⅡ的表達量顯著升高（P＜0.05）。結論不同濃度異丙酚處理會抑制神經干細胞增殖促進凋亡，CaMKⅡ-p38通路有重要作用，為臨床麻醉用藥的合理性和安全性提供試驗基礎。

異丙酚；神經干細胞；凋亡；CaMKⅡ；p38

異丙酚是廣泛應用于臨床麻醉誘導和維持以及重癥患者鎮(zhèn)靜的靜脈麻醉藥物［1］，通過激活γ-氨基丁酸（GABA）受體-氯離子復合物發(fā)揮對中樞神經系統的作用。近期研究顯示，異丙酚能改變突觸的可塑性，對患者記憶和認知功能造成不利影響，其神經毒性作用可能會引起患者術后認知功能的減退［2］。本研究以體外培養(yǎng)的大鼠神經干細胞為模型，探討不同濃度的異丙酚對神經干細胞的增殖和凋亡的影響以及CaMKⅡ-p38通路在其中的作用，為臨床麻醉用藥的合理性和安全性提供試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

C57/BL小鼠購自南京君科生物科技有限公司（貨號為J006）；DMEM/F12培養(yǎng)基購自HyClone公司；異丙酚（批號為ET763，10 mg/mL，AstraZeneca公司）；p38，p-CaMKⅡ抗體購自Avcam公司。細胞培養(yǎng)箱、離心機購自Thermo公司，電泳儀及凝膠成像系統購自Bio-Rad，流式細胞儀購自BD公司。

1.2 方法

神經肝細胞培養(yǎng)：成年C57/BL小鼠20只，其中雌性15只，雄性5只，體重20 g，10～12周齡，顆粒飼料室溫23℃，濕度55%喂養(yǎng)，按雌雄比2∶1合籠交配，孕鼠分籠喂養(yǎng)。取孕14 d小鼠，以頸椎脫臼法處死，無菌下剪開皮膚和肌肉層，暴露子宮，將胎鼠轉移至裝有4℃Hanks液的培養(yǎng)皿中，于超凈工作臺中，剪開子宮，取胎鼠大腦皮層，在顯微鏡下剝離大腦皮層外膜。機械消化法制備單細胞懸液，取少數細胞懸液臺盼藍染色，計數活細胞比例，調整細胞濃度為1×106/mL，鑒定并置37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)。

藥物處理：取神經干細胞懸液孵育6 h，待完全貼壁后，隨機分為5組，每組3孔，分別為異丙酚低、中、高濃度組（A1，A2，A3組），對照組（B組）及溶劑組（C組），A1，A2，A3組分別給予2.5，5.0，10.0μg/mL異丙酚，B組不作處理，C組給予脂肪乳替代異丙酚，于37℃及5%CO2條件下培養(yǎng)12，48，72 h。

四氮唑鹽（MTT）法測定增殖活性［2］：收集對數期細胞，調節(jié)細胞懸液濃度至1×106/mL個細胞。每孔加入MTT溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。以1 000 r/min的速率離心10min，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）100μL，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 570 nm（630 nm校準）測量各孔的吸光度。增殖抑制率=（1-試驗組OD值/對照組OD值）×100%。

流式細胞術測定細胞凋亡情況：直接收集懸浮細胞到10mL的離心管中，每個樣本有（1～5）×106/mL個細胞，以1 000 r/min的速率離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用孵育緩沖液洗滌1次，500～1 000 r/min離心5min。用100μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15min。500～1000 r/min離心5min，沉淀細胞孵育緩沖液洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20min，避光并不時振動。流式細胞儀分析：流式細胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測異硫氰酸熒光素（FITC）熒光，另一波長于560 nm的濾器檢測磺化丙啶（PI），左上象限為死亡細胞，右上及右下象限為凋亡細胞。

Western Blot法檢測相關蛋白：收集細胞，加200μL裂解液［50 mmol/L Tris-Hcl pH 8.0，150 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），0.1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40），蛋白酶抑制劑］。4℃12 000 r/min離心15min，取上清液，采用Bradford法檢測蛋白濃度；取上述制備的蛋白樣品50μg上樣到15%SDS-PAGE凝膠，電泳完畢后將蛋白電轉至硝酸纖維素（NC）膜，用5%脫脂奶粉封閉，分別加一抗，37℃孵育2 h，經0.1%TBST漂洗后加二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜后加ECL，X線膠片定影，掃描后用IPP 6.0進行圖像分析。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 細胞增殖情況

以MTT法對不同組別細胞增殖活性進行測定，結果顯示，B組及C組細胞生長活躍，采用不同濃度的異丙酚處理12 h后細胞增殖率無顯著性差異（P＞0.05），處理48，72 h后增殖抑制率呈現出濃度和時間依賴性，見圖1。

圖1 不同細胞增殖情況

2.2 細胞凋亡情況

細胞處理48 h后，采用流式細胞術對各組細胞凋亡情況進行分析。與B組相比，C組細胞凋亡率與死亡率無顯著性差異（P＞0.05），A組凋亡率和死亡率顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見表1。

表1 各組細胞凋亡情況（±s，%）

表1 各組細胞凋亡情況（±s，%）

注：與B組相比，*P＜0.05。

死亡率1.62±0.18 1.71±0.20 2.82±0.42*4.02±0.51*6.28±0.66*組別B組C組A1組A2組A3組凋亡率3.81±0.19 4.02±0.26 11.17±3.84*21.59±4.92*35.27±5.11*

2.3 W estern Blot法相關蛋白分析

采用Western Blot法對各組細胞中p38及CaMKⅡ表達水平進行分析。與B組相比，各組p38及CaMKⅡ的表達量無顯著性差異（P＞0.05），而隨著異丙酚處理濃度的提高，p-p38及p-CaMKⅡ的表達量顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 異丙酚對各組細胞P38及CaMKⅡ表達的影響

3 討論

異丙酚因起效快、蘇醒迅速及完全的特性被廣泛用于臨床靜脈麻醉［3］，單獨使用異丙酚進行靜脈麻醉可能會降低術后嘔吐及眩暈的發(fā)生；此外，異丙酚的免疫調節(jié)、抗焦慮、促進一氧化氮（NO）合成［4］、抗氧化、抗血小板聚集［5］及神經保護作用［6］也被研究人員所發(fā)現。近年的研究顯示，異丙酚能誘發(fā)神經元凋亡［7］，引起突觸結構發(fā)育異常，損害學習和記憶能力。通過體外試驗研究不同濃度異丙酚對神經干細胞的增殖和凋亡的影響及相關作用機制，可為臨床麻醉用藥的合理性和安全性提供試驗基礎。

異丙酚對細胞凋亡早期啟動階段的作用及關鍵靶點研究較少，異丙酚在短時間內能激活ERK信號通路，改變線粒體凋亡相關通路基因的轉錄水平。絲裂原信號激酶（MAPK）在細胞的凋亡中往往扮演著重要角色，MAPK家族中的細胞外信號激酶（ERK），p38及c-jun氨基端激酶（JNK）在化學物質和應激條件下活化，與細胞凋亡關系密切。活化的MAPK引起線粒體介導的細胞凋亡程序，伴隨細胞色素C的釋放及半胱天冬酶的激活。Ca2+是細胞內重要的細胞信號分子，各種刺激會導致細胞內的Ca2+濃度升高，與鈣調蛋白（CaM）結合發(fā)揮多種生物學作用，包括遷移、增殖及信號轉導，Ca2+/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）是Ca2+信號通路中重要的分子［8］，與Ca2+結合后發(fā)生自身磷酸化［9］，參與多種信號轉導。多項研究表明，Ca2+-CaMKⅡ途徑的激活會進一步激活轉化生長因子β激活激酶（TAK1），激活MAPK家族的p38激酶［10-11］，進而應激活化激酶（JNK）誘導細胞凋亡［12］，CaMKⅡ可引起線粒體去極化，釋放細胞色素C，激活半胱天冬酶介導的細胞凋亡。本研究中分析了不同劑量的異丙酚對神經干細胞凋亡的影響及CaMKⅡ-p38通路在其中的作用，結果顯示，不同濃度的異丙酚處理12 h后細胞增殖率無顯著性差異，處理48 h及72 h后呈現出濃度和時間依賴性，表明高濃度的異丙酚能抑制神經干細胞的增殖，而隨著異丙酚處理濃度的增加p38及CaMKⅡ的表達水平較對照組無顯著性改變；但p38及CaMKⅡ的表達量顯著升高，表明異丙酚通過促進p38及CaMKⅡ的磷酸化，激活CaMKⅡ-p38通路，在異丙酚誘導神經干細胞凋亡的過程中扮演重要角色。

綜上所述，異丙酚作為臨床常用的靜脈麻醉藥物，高于臨床有效血藥濃度處理神經干細胞會抑制細胞增殖，促進凋亡。Ca2+誘導的CaMKⅡ-p38通路在其誘導神經干細胞凋亡中有重要作用，可為臨床麻醉用藥的合理性和安全性提供試驗基礎。

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Role of CaMKⅡ-p38 Pathway in the Apoptosis of Propofol Induced Neural Stem Cell

Wang Hongmei
（Chongqing Institute of Tumor，Chongqing，China 400030）

Objective To analyze the effect of different concentrations of propofol on neural stem cell apoptosis and the role of CaMKⅡ-p38 pathway.Methods Rats embryonic neural stem cells and pregnant 14 d were selected and divided into low，medium and high concentrations of propofol 2.5，5.0 and 10.0μg/mL propofol，the control group（no treatment）and the solvent group（fat emulsion）and analyzed the cell proliferation and apoptosis.The expression of CaMKⅡand p38 was analyzed by Western Blot.Results The cell proliferation had no significant difference after 12 h of different concentrations of propofol（P＞0.05），48 h and 72 h after treatment showed concentration and time dependent；compared with the control group，the apoptosis rate and mortality of the solvent group had no significant difference（P＞0.05），while the apoptosis rate and mortality were significantly increased in different concentrations of propofol（P＜0.05），and showed a dosage-dependent manner；with the increase of propofol concentrations，P-P38 and P-CaMKⅡexpression were significantly increased（P＜0.05）.Conclusions Different concentrations of propofol can inhibit proliferation of neural stem cells，induce apoptosis；CaMKⅡ-p38 pathway has an important role on providing an experimental basis for the rational and safe clinical anesthesia medication.

propofol；neural stem cells；apoptosis；CaMKⅡ；p38

R962；R971+.1

A

1006-4931（2015）22-0073-03

王洪梅，大學本科，藥師，研究方向為臨床藥學，（電話）023-65301592（電子信箱）31767834@qq.com。

2015-07-03）