重樓皂苷D抑制A549細胞轉移作用及機制研究

呂蕓，李曉玲

（1.陜西省西安市第四醫院，陜西西安710004；2.中國人民解放軍第四軍醫大學，陜西西安710032）

重樓皂苷D抑制A549細胞轉移作用及機制研究

呂蕓1，李曉玲2

（1.陜西省西安市第四醫院，陜西西安710004；2.中國人民解放軍第四軍醫大學，陜西西安710032）

目的觀察重樓皂苷D對結腸癌細胞A549遷移與侵襲，以及基質金屬蛋白酶2及9（MMP-2，MMP-9）表達的影響。方法培養結腸癌細胞A549，加入不同質量濃度的重樓皂苷D（1，2μmol/L），采用劃痕試驗，Transwell侵襲試驗觀察重樓皂苷D對A549遷移與侵襲的影響，以免疫印跡試驗（Western Blot）法檢測細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達。結果與結論重樓皂苷D可有效抑制結腸癌細胞A549的遷移、增殖與侵襲，可濃度依賴性地降低MMP-2和MMP-9的表達。機制可能為其降低了MMP-2和MMP-9的表達。

重樓皂苷D；遷移；侵襲；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶-9

40%的肺癌患者初診時已發生淋巴結轉移，確診肺癌后5年生存率不足13%，這與肺癌易發生侵襲、轉移有關［1］。因此，尋找能有效抑制肺癌轉移的藥物，對于改善肺癌患者的生存質量具有重要意義。重樓又名七葉一枝花，為百合科植物，以根莖入藥，具有鎮咳平喘、消腫止痛、清熱定驚、敗毒抗癌等功效；主要用于針對癰腫肺癆久咳、淋巴結核、骨髓炎、跌打損傷、蛇蟲咬傷等癥；具有生物活性的主要成分是多種甾體皂苷［2-4］。本試驗中觀察了重樓皂苷D對肺癌細胞A549增殖與轉移的抑制作用，并初步研究了其相關作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

重樓皂苷D（純度＞98%）購自上海純優生物有限公司。人肺癌細胞株A549購于美國ATCC公司；培養基（DMEM，Hyclone公司，批號為NAD1269）；胎牛血清（Thermo Fisher公司，批號為140202）；胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA，北京索萊寶公司，批號為20140211）；β-肌動蛋白（actin）抗體（Bioworld公司，批號為AP0060）；基質金屬蛋白酶（MMP）-2，9抗體（Epitomic公司，批號為ARE6040，ARE6041）。

1.2 方法

細胞培養及藥物處理人肺癌細胞：將A549細胞加入含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，置37℃及5%CO2細胞孵箱內培養。重樓皂苷D以DMSO配置為1mmol/L母液，置4℃冰箱保存，臨用前稀釋成工作濃度，工作濃度為1，3，10，30μmol/L。

MTT法檢測細胞增殖率：取生長良好的A549細胞以2×103個/孔的密度接種于96孔板內，置37℃及5%CO2培養箱中過夜，使細胞充分貼壁后隨機分組，每組設3個平行孔。給藥處理組分別加入含各種濃度的重樓皂苷培養液（1，3，10，30μmol/L）200μL，并繼續培養24 h。取出培養板，每孔加入5 g/LMTT溶液20μL，再繼續孵育4 h。棄去孵育液，每孔加入150μLDMSO，于微量振蕩儀上低速振蕩10min，待結晶物充分溶解后，在Bio-Rad酶標儀上檢測各孔在490 nm波長處的吸光度（OD）值。計算細胞增殖率，細胞增殖率（%）=（試驗組OD值-對照組OD值）/對照組OD值×100%。重復3次。

劃痕試驗：取生長良好、處于對數生長期的A549細胞，以2×105個/孔密度接種至24孔板中。待細胞貼壁生長至融合時（約24 h），用200μL移液頭在細胞層上劃出一道劃痕。磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次后，加入含1.5%胎牛血清的DMEM培養液，倒置顯微鏡下捕捉0 h劃痕圖片。培養24 h后，顯微鏡再次捕捉劃痕圖片。

Transwell侵襲試驗：包被基底膜，50mg/L的基膜基質以1∶8稀釋，包被Transwell小室底膜的上表面（約80μL/孔），室溫風干；水化基底膜，吸出孔中殘余液體，每孔加入50μL含1%牛血清白蛋白（BSA）的無血清培養液，37℃孵育30min；接種細胞，制備細胞懸液，細胞濃度調整為5×105/mL，每孔膜的上層加入細胞懸液100μL，下層加入含5%胎牛血清的DMEM培養液。細胞培養12 h后，用4%多聚甲醛室溫固定膜下層細胞15min。PBS清洗3次后，行結晶紫染色，顯微鏡照相，捕捉圖片。

免疫印跡試驗（Western Blot）法測定MMP-2和MMP-9的表達：以細胞刮刮取對照組和重樓皂苷D處理24 h（1，2μmol/L）細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，蛋白定量、變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜。NC膜用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加兔抗MMP-2（1∶500）、MMP-9（1∶500）及鼠抗β-actin（1∶1 000）一抗4℃孵育過夜，PBS洗膜后加1∶7 000稀釋的相應辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗，室溫孵育2 h，洗膜后，采用ECL發光液進行化學發光。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0統計軟件中的單因素方差分析（ANOVA）進行數據統計。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑制A549細胞的增殖

以不同濃度重樓皂苷D處理A549細胞24 h后，采用MTT法測定各組OD值。結果顯示，與對照組相比，重樓皂苷D（1，3，10，30μmol/L）作用于細胞24 h后能顯著抑制A549細胞增殖，抑制率分別為（10.01±1.07）%，（17.67±3.01）%，（54.96±8.13）%，（71.66±4.61）%（P＜0.01），作用呈濃度依賴性，見圖1。

圖1 重樓皂苷D對A549細胞增殖的影響

2.2 抑制A549細胞的遷移

1μmol/L及2μmol/L的重樓皂苷D孵育細胞24 h后，細胞的遷移均受到明顯抑制，抑制率為（23.46±3.53）%和（48.92±4.26）%（P＜0.01），作用呈一定的濃度依賴性，見圖2。

圖2 重樓皂苷D對A549細胞遷移的影響

2.3 抑制A549細胞的侵襲

在對照組中，大量的A549細胞從上層侵入到下方的小室。在重樓皂苷D處理各組，從上層進入下方小室的細胞顯著減少（P＜0.01）。醋酸溶解結晶紫后，在570 nm波長處讀取OD值，發現該作用呈濃度依賴性，1μmol/L組和2μmol/L組侵襲抑制率分別為（21.33±4.63）%和（56.37±2.11）%（P＜0.01），見圖3。

圖3 重樓皂苷D對A549細胞侵襲的影響

2.4 對A549細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

Western Blot法檢測結果表明，重樓皂苷D可使A549細胞中MMP-2和MMP-9的表達水平呈濃度依賴性降低，見圖4。

圖4 重樓皂苷D對A549細胞中MMP-2，MMP-9表達的影響

3 討論

本試驗結果表明，重樓皂苷D可濃度依賴性地抑制A549的遷移和侵襲。腫瘤遷移和侵襲是決定腫瘤惡性程度的重要因素。腫瘤細胞外基質及基底膜的降解和破壞在腫瘤浸潤和轉移過程中發揮重要作用。MMPs是一類與鋅結合、能降解細胞外基質活性的酶類，在正常生理條件下，其合成、分泌及降解受到嚴格調控。而惡性腫瘤細胞分泌的MMPs酶活性明顯增強，可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。在MMPs中，MMP-2和MMP-9是參與細胞外基質降解的主要成分，這兩者是不同形式的Ⅳ型膠原酶，又稱明膠酶A和明膠酶B。MMP-2主要由腫瘤間質細胞分泌，MMP-9則主要由腫瘤細胞分泌［5-10］。本研究結果顯示，重樓皂苷D可濃度依賴性地降低細胞中MMP-2和MMP-9的表達水平。

綜上所述，重樓皂苷D可能通過下調MMP-2和MMP-9的水平，從而發揮抑制A549細胞侵襲與遷移的作用。雖然重樓皂苷D的抑制結腸癌細胞轉移的活性與機制有待進一步研究，但該結果將為重樓及其成分開發提供依據。

［1］Siege R，Ma JM，Zou ZH，et al.Cancer statistics 2014［J］.CA：A Cancer Journal for Clinicians，2014，64：9-29.

［2］金煒東，陳孝平，蔡紅嬌，等.重樓提取物對HepG2細胞的毒性作用［J］.華中科技大學學報：醫學版，2006，35（1）：103.

［3］顧琳慧，馮建國，錢麗娟，等.重樓皂苷Ⅰ對高轉移人卵巢癌細胞體外

生長抑制功能的研究［J］.中華中醫藥學刊，2012（10）：2212-2215.

［4］董銳增，郭劍民，張則偉，等.重樓皂苷Ⅰ聯合加熱抗胃癌MKN-45細

胞株增殖的體外研究［J］.中華中醫藥學刊，2012，30（8）：1 809-1 812.

［5］Leeman MF，Curran S，Murray GI.New insights into the roles ofmatrix

metalloproteinases in colorectal cancer development and progression［J］.J Pathol，2003，201（1）：528-534.

［6］Friedl P，Wolf K.Tumour-cell invasion and migration：diversity and escape mechanisms［J］.Nature Reviews Cancer，2003，3（5）：362-374.

［7］Zhou L，Zhag G，Tang T，et al.Retrospective analysis of clinical and pathologic risk factors in liver resection for hepatic colorectalmetastases［J］. Journal of Cancer Research and Therapeutics，2013，9：S178-S182.

［8］李志泉，陳曉艷，岳正剛，等.重樓皂苷Ⅵ預防結腸炎癌變的作用及機制［J］.世界華人消化雜志，2014（22）：4 393-4 398.

［9］Liska V，Sutnar A，Jr LH，et al.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in correlation to proliferative and classical tumourmarkers during surgical therapy of colorectal liver metastases［J］.Bratislavske Lekarske Listy，2012，113（2）：108-113.

［10］Kim SY，Kim DH，Han SJ，et al.Repression of matrix metalloproteinase gene expression by ginsenoside Rh2 in human astroglioma cells［J］.Biochemical Pharmacology，2007，74（11）：1 642.

Effect and Mechanism of Polyphyllin D on Metastasis of A549 Cells

Lyu Yun1，Li Xiaoling2
（1.The Fourth hospital of Xi′an，Xi′an，Shaanxi，China 710004；2.The Fourth Military Medical Universtiy，Xi′an，Shaanxi，China 710032）

Objective To investigate the effects of Polyphyllin D on the migration and invasion and the expression MMP-2，MMP-9 in human lung cancer cells A549.Methods A549 cells were administered with different concentrations of Polyphyllin D（1，2μmol/L）. Cell migration and invasion were then evaluated by wound healing and trans well assays.MMP-2 and MMP-9 expression were assessed by Western blot.Results Polyphyllin D can inhibit the migration and invasion of A549 significantly.Polyphyllin D can reduce MMP-2 and MMP-9 expression in a concentration dependent manner.Conclusion Polyphyllin D can inhibit A549 migration and invasion，the mechanism may be the expression of MMP-2 and MMP-9 are affected.

Polyphyllin D；migration；invasion；MMP-2；MMP-9

R285.5；R282.71

A

1006-4931（2015）22-0035-02

2014-10-27；

2015-04-21）