廣西紅樹林根際土壤放線菌的原位培養分離及其活性篩選

姜明國，甘光華，楊立芳，李西妮，楊桂柳，庹利，孫承航，黃玲，藍金枝

（1.廣西紅樹林保護與利用重點實驗室，廣西北海536000；2.廣西民族大學廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室，廣西南寧530008；3.廣西民族大學化學化工學院廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西南寧530008；4.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫藥生物技術研究所，北京100050）

廣西紅樹林根際土壤放線菌的原位培養分離及其活性篩選

姜明國1，2，甘光華1，2，楊立芳3*，李西妮2，楊桂柳2，庹利4，孫承航4，黃玲3，藍金枝3

（1.廣西紅樹林保護與利用重點實驗室，廣西北海536000；2.廣西民族大學廣西高校微生物與植物資源利用重點實驗室，廣西南寧530008；3.廣西民族大學化學化工學院廣西林產化學與工程重點實驗室，廣西南寧530008；4.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫藥生物技術研究所，北京100050）

為了發掘廣西紅樹林根際土壤的放線菌資源，本文利用原位培養裝置，埋于根際土壤中俘獲放線菌，30 d后取回實驗室，采用平板涂布法對4個地點的原位培養樣品于15種培養基上進行分離純化；對分離株基于16S rR N A基因序列進行系統發育分析；進一步進行抗菌活性和產酶活性檢測。共分離得到113株放線菌。對其中33株放線菌進行測序，結果表明20株屬于鏈霉菌屬，11株屬于擬諾卡氏菌屬，1株屬于倫茲氏菌屬，1株與擬諾卡氏菌屬相似性最高為90%，很可能屬于放線菌一個新屬。抗菌實驗結果顯示其中有7株、4株、18株、6株、10株、3株實驗菌株分別對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、乙型溶血性鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌具有抑制作用；有55株、62株、24株、72株的實驗菌株分別具有纖維素酶活性、淀粉酶活性、膠原蛋白酶活性、酯酶活性。原位培養可以豐富對廣西紅樹林根際土壤的認識，分離到了新種甚至可能是新屬的放線菌，分離得到的部分放線菌菌株具有較高生物活性，為后續工作提供了良好的實驗材料。

原位培養；紅樹林；根際土壤；放線菌；生物活性

姜明國，甘光華，楊立芳，等.廣西紅樹林根際土壤放線菌的原位培養分離及其活性篩選［J］.海洋學報，2015，37（2）：55—64，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.02.006

Jiang Mingguo，Gan Guanghua，Yang Lifang，et al.In situisolation of actinomycetes and screening bioactive potential from mangrove rhizosphere soi ls in Guangxi［J］.Haiyang Xuebao，2015，37（2）：55—64，doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2015.02.006

1　引言

分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落稱之為紅樹林，是海洋向陸地的過渡帶。紅樹林是至今世界上少數幾個物種最多樣化的生態系之一，有著不同于陸地的性質：水分高、鹽分高以及氧氣缺乏，其地下部分的微生物較之其他生態系統有很大的差異，這就賦予了紅樹林土壤微生物產生活性物質的潛在可能性［1］。廣西紅樹林面積占全國紅樹林面積的三分之一，蘊藏著巨大的海洋微生物資源。

目前，科研工作者能在實驗室條件下培養出來的微生物，只占到微生物總體的0.1%～1%，絕大部分的微生物不能通過傳統的培養方法獲得［2］。模擬自然環境和保持微生物間的共生關系是提高微生物培養具備共性的關鍵問題，目前開發新的策略培養傳統“不可培養”微生物的需求十分迫切。探索更加有效的分離方法，從海洋等極端環境中分離篩選活性菌株已成為當前微生物資源開發利用的重要研究方向［2—3］。原位培養即構建模擬微生物生存的環境系統。目前可以使用“擴散室”和“載體”兩種類型的原位培養模式［4—5］。A oi等設計了一種中空纖維膜室培養裝置，能同時用于多個簡單樣品的純培養［6］。Gavrish等采用這種擴散室裝置成功的對特殊和稀有放線菌進行了培養分離［7］。Lewis和Nichols等采用高通量的“擴散室”培養以前未能培養的微生物，發現的新種遠遠多于用傳統培養皿進行培養［8—9］。可見原位培養方法在微生物的研究領域具有巨大的潛力。

目前關于紅樹林根際土壤放線菌的分離培養大多采用傳統的分離方法，采用原位培養法進行放線菌分離培養未見報道。我們利用放線菌產生菌絲的特點制作放線菌原位俘獲裝置，置于不同品系的紅樹林根際土壤中進行共培養，旨在培養出傳統分離培養方法不能分離培養的紅樹林根際土壤放線菌。并對所分離到的放線菌進行生物活性評價，為后續海洋放線菌次生代謝產物的研究奠定基礎。

2　材料和方法

2.1材料

2.1.1實驗地點

廣西山口紅樹林保護區、北海紅樹林育種中心、廣西合浦老鼠簕紅樹林和東興北侖河口紅樹林保護區。

表1　廣西紅樹林原位培養放線菌埋樣地點Tab.1 Description ofin situcultivation sites

2.1.2培養基：

原位培養基：瓊脂粉30%，海水1 L，自然p H值。

分離培養基：配制以下15種培養基，海水定容至1 L，自然p H值用于菌株分離。

A.酵母膏-麥芽膏培養基（Y E M E）：酵母粉4 g，麥芽浸出粉10 g，葡萄糖4 g，瓊脂18 g；

B.改良E merson培養基：葡萄糖1 g，酵母粉1 g，蛋白胨4 g，氯化鈉2.5 g，瓊脂18 g；

C.2216E培養基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，磷酸高鐵0.1 g，瓊脂18 g；

D.M 1培養基：可溶性淀粉10 g，酵母粉4 g，蛋白胨2 g，瓊脂18 g；

E.ISP2培養基：葡萄糖4 g，酵母粉4 g，麥芽浸出粉10 g，碳酸鈣2 g，瓊脂18 g；

E.酪蛋白-酵母浸汁培養基：酪蛋白7.5 g，酵母浸汁10 g，七水硫酸鎂2 g，檸檬酸鈉3 g，氯化鉀2 g，氯化鈉2 g，瓊脂18 g；

G.H V G培養基：腐植酸1 g，磷酸氫二鈉0.5 g，七水硫酸鎂0.05 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，碳酸鈣0.02 g，維生素B母液1 ml，瓊脂18 g；

H.SC培養基：可溶性淀粉10 g，酪蛋白1 g，瓊脂18 g；

I.葡萄糖-天門冬素瓊脂培養基：葡萄糖10 g，天門冬素0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，瓊脂18 g；

G.無機鹽瓊脂培養基：可溶性淀粉20 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，硝酸鉀1 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂18 g；

K.改良ISP5培養基：酵母膏5 g，L-門冬酰胺1 g，甘油10 g，磷酸氫二鉀1 g，硝酸鉀5 g，微量鹽1 m L，瓊脂18 g；

L.甘油瓊脂培養基：蛋白胨5 g，酵母膏3 g，甘油20 g，瓊脂18 g；

M.G Y ESA培養基：葡萄糖10 g，酵母膏10 g，可溶性淀粉10 g，氯化鈉5 g，碳酸鈣3 g，瓊脂18 g；

N.高氏一號培養基：可溶性淀粉20 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂18 g；

O.察氏培養基：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，七水硫酸亞鐵0.01 g，七水硫酸鎂0.5 g，蔗糖30 g，瓊脂18 g；

純化培養基：ISP2培養基：葡萄糖4 g，酵母粉4 g，麥芽浸出粉10 g，碳酸鈣2 g，瓊脂18 g，海水加至1 L，自然p H值。

以上所有培養基在冷卻至55°C左右時加入終濃度為100μg/m L的重鉻酸鉀作為細菌和真菌的抑制劑。

生物活性檢測培養基：

（1）淀粉水解培養基：可溶性淀粉10 g，磷酸氫二鉀0.3 g，氯化鈉0.5 g，七水硫酸鎂1 g，硝酸鉀1 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 L，p H 7.2～7.4。

（2）明膠培養基：蛋白胨5 g，葡萄糖20 g，明膠200 g，蒸餾水1 000 m L，p H 7.2～7.4。

（3）酯酶活性篩選培養基：吐溫-80為10 g，硝酸銨1 g，氯化鈣0.1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鐵0.02 g，磷酸二氫鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈉1.0 g，蒸餾水1 L，p H 7.0～7.2。

（4）纖維素酶活性篩選培養基：微晶纖維素8 g，硝酸銨1 g，氯化鈣0.1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，氯化鐵0.02 g，磷酸二氫鉀0.5 g，酵母粉0.05 g，七水硫酸鎂0.5 g，氯化鈉1 g，蒸餾水1 L，p H 7.0～7.2。

2.1.3指示菌株

大腸埃希氏桿菌（E.coliC M CC 44102）、銅綠假單胞菌（P.aeruginosaC M CC 10104）、金黃色葡萄球菌（S.aureusC M CC 26003）、普通變形桿菌（P.vulgarisC M CC 49027）、乙型溶血性鏈球菌（β-StreptococcusAT CC 21059）和肺炎克雷伯氏菌（K.pneumoniae C M CC 46117）。以上6株指示菌株由本實驗室保藏。

2.1.4主要試劑

P G E M-T Easy Vector（Promega），瓊脂粉，葡萄糖，酵母粉，麥芽浸出粉，可溶性淀粉，瓊脂糖，異丙醇，乙醇，胰蛋白胨等，試劑均為分析純。

2.1.5儀器

L D Z X-50 K BS立式壓力蒸汽滅菌器，H PS-250生化培養箱，L E G E N DM IC R017離心機，格蘭特X B70制冰機，H R-7803D微波爐，H H-6數顯恒溫水浴鍋，JY-600電泳儀，BIO-R A D凝膠成像分析儀，BIO-R A D PC R儀，Supra 55 Sapphire型掃描電子顯微鏡等。

2.2放線菌分離與純化

2.2.1原位培養裝置的制作

將已滅菌的0.22μm的親水性下濾膜（購自Mi ll ipore中國有限公司）用502膠水與已滅菌的不銹鋼圈貼好，向中空內環倒入約3 m L原位培養基，待培養基冷卻凝固后，將親水性上濾膜和不銹鋼圈用膠水密封（圖1）。

2.2.2埋原位培養裝置

將原位培養裝置埋于紅樹林根際附近土壤中，深度為5～10 cm，每個地點都埋50個原位培養裝置。整個埋樣過程及取樣后處理如圖2所示。

2.2.3放線菌的分離純化

30 d后將原位培養裝置取回清潔后，將原位培養基轉移到無菌1.5 m L的E P管中，加入無菌水，將原位培養基搗碎并充分與無菌水混勻，吸取混懸菌液100μL涂布于15種分離培養基上，置28℃恒溫培養箱中培養6～15 d。將形態較典型的放線菌菌落挑出，經過3～5次平板劃線分離純化后轉種到ISP2斜面培養基中保存，編號后置于4°C冰箱中保存備用。

圖1　放線菌原位俘獲裝置Eig.1 Actinobacteriain situcultivation trap

圖2　原位培養裝置的使用：埋樣前（a）、取樣中（b）、清理后（c）Eig.2 Appl ication of thein situcultivation chambers：general view of the chambers（a），the chambers in use（b），after the clean-up（c）

2.3放線菌16S rRNA基因序列測定及系統發育分析

采用微波熱震蕩［10］提取放線菌基因組D N A，16S rR N A基因序列的PCR擴增，使用以下兩個通用引物：27E：5′-A G A G T T T G AT CC T G G C T C A G-3′，1492R：5′-A A G G A G G T G AT CC A G CC G C A-3′（由上海捷瑞公司合成），PCR擴增反應體系（25μL）：引物（10μmol/L）各0.5μL，模板D N A（50～100 ng）1μL，2×PCR Master Mix 12.5μL，加無菌雙蒸水補至25μL。PC R反應條件為：95℃預變性4 min；95℃變性1 min，55℃復性1 min，72℃延伸1 min，30個循環；最后72℃溫育10 min。擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測。PCR擴增產物經電泳檢測后，進行切膠純化，用T載體置于4℃冰箱過夜連接，將菌株的16S rR N A轉化到E.coli（T OP10E′），經氨芐篩選陽性克隆，隨機挑取陽性克隆子于37℃在含有氨芐的LB液體培養基搖床220 r/min，37°C培養15 h。用T7引物：5′-TA ATA C G A C T C A C TATA G G G-3′，SP6引物：5′-AT T TA G G T G A C A C TATA G-3′）進行PC R，電泳檢測有目的條帶的菌液送到生工生物工程股份有限公司進行測序。

將測序得到的基因序列運用BL AST程序在GenBank數據庫中進行同源性分析。利用M E G A5軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining method）構建系統進化發育樹。

2.4菌株生物活性檢測

2.4.1菌株抑菌活性檢測

選用以上6株指示菌株進行放線菌抗菌活性試驗。所有細菌指示菌株都用ISP2培養基培養，采用點植法培養7 d后，觀察抑菌圈并測量抑菌圈的直徑。

2.4.2菌株酶活檢測

采用用點植法培養7 d后，通過Lugol碘液檢測淀粉酶活性，通過觀察透明圈檢測膠原蛋白酶和脂肪酶活性，通過觀察菌落四周澄清的暈環檢測纖維素酶活性。

3　結果和分析

3.1原位培養裝置俘獲放線菌的效果

取回原位培養裝置后，將原位培養基取出，置于倒置顯微鏡中觀察，可以看到許多具有分枝狀菌絲的菌落分散在原位培養基內。根據菌落的形態初步判斷原位培養基內的菌落為放線菌。將原位培養基菌懸液涂布后，可得到較多的放線菌菌落，并且無細菌和真菌的出現（圖3）。表明所采用的原位培養裝置能較為單一地俘獲放線菌并且效果良好。值得注意的是，有部分原位培養裝置的濾膜遭蟲蝕而破損、膠水粘得不牢固導致脫落損壞或取樣的時候被不小心戳破造成了一定的污染，這是值得改進的地方。

圖3　原位培養基菌懸液涂布分離放線菌的效果Eig.3 Isolation plates of actinomycetes，which were spread within situcultivation medium suspensions and incubated at 28°C for 6 to 15 d

3.2放線菌分離結果

采用原位培養方法從廣西山口紅樹林保護區、北海紅樹林育種中心、廣西合浦老鼠簕紅樹林和東興北侖河口紅樹林保護區分別得到22株、20株、70株和1株，總共獲得113株放線菌。放線菌菌落大多氣生菌絲發達，菌落致密干燥，菌落顏色多為白色，其次為灰色，有少數菌株菌落為紅色或嫩黃色。其中分離到的放線菌G X U N10可能是放線菌新菌株（圖4）。

圖4　放線菌G X U N10的菌落形態（a）及其電鏡圖（b）Eig.4 Colony morphology（a）and electron micrograph（b）ofisolate G X U N10

3.3不同培養基分離放線菌的效果

圖5是不同培養基分離的放線菌數量的比較，培養基種類標號來源于分離培養基的編號。結果表明，ISP2培養基分離得到的紅樹林根際土壤放線菌菌株數量最多，其次是M 1培養基和無機鹽瓊脂培養基，H V G培養基、改良ISP5培養基和甘油瓊脂培養基分離得到的菌株數量最少。由于不是唯一碳源培養基，所以不能確定哪種碳源對分離放線菌最有優勢，但也可以看出，所選用的15種分離培養基中ISP2培養基、M 1培養基和無機鹽瓊脂培養基最適合用來分離紅樹林根際土壤放線菌。

3.4廣西紅樹林根際土壤放線菌的多樣性

用上述15種分離培養基從廣西4個地方的紅樹林原位培養樣品中分離并保藏放線菌113株，測序了33株。測得33株放線菌菌株的16S rR N A基因序列全長接近1 490 bp。用BL AST軟件從GenBank數據庫中搜索相似序列，然后采用鄰接法構建放線菌與其相關菌株的系統發育樹，結果（見圖6）顯示，33株放線菌分布于放線菌亞綱3個目3個科的4個屬。鏈霉菌目Streptomycineae中的鏈霉菌科Streptomycetaceae中的鏈霉菌屬Streptomyces20株；鏈孢囊菌目Streptosporangineae擬諾卡氏菌科Nocardiopsaceae中擬諾卡氏菌屬Nocardiopsis11株；假諾卡氏菌目Pseudonocardineae中的假諾卡氏菌科Actinosynnemataceae中的倫茲氏菌屬Lentzea1株；另外一株編號為G X U N10的放線菌在基于16S rR N A基因序列構建的系統發育樹上獨立劃分為一個分支，與鏈孢囊菌目中NocardiopsisalbaPC M 2702的序列相似性最高，但相似性僅為90%，所以G X U N10很可能為鏈孢囊菌目Streptosporangineae中的新科或新屬［11］。該菌的多相分類學研究工作正在進行中。

圖5　不同培養基分離到的紅樹林根際土壤放線菌菌落數對比Eig.5 Isolate numbers of marine actinobacteria on different media

圖6　鄰接法構建基于16S rR N A基因序列的系統發育樹Eig.6 Phylogenetic neighbour-joining tree based on the 16SrR N A gene sequences of the isolated strains

3.5生物活性檢測結果

3.5.1菌株抑菌活性檢測結果

對113株紅樹根際土壤放線菌進行了抗細菌活性的初步檢測，發現47株放線菌樣品在一種或多種指示菌篩選中顯示為陽性（表2），初篩陽性率為41.59%。有6.19%、3.54%、15.93%、5.31%、8.85%、2.65%的實驗菌株分別對大腸埃希氏桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、乙型溶血性鏈球菌和肺炎克雷伯氏菌具有抑制作用。其中，源于廣西山口紅樹林保護區（Shankou）的22株菌中，初篩陽性菌株為5株，陽性率為22.73%；源于北海紅樹林育種中心（Yuzhong）的20株菌中，初篩陽性菌株為11株，陽性率為55.00%；源于廣西合浦老鼠簕紅樹林（Hepu）的70株菌中，初篩陽性菌株為31株，陽性率為44.29%；源于東興北侖河口紅樹林保護區（Dongxing）的1株菌中，初篩無陽性菌株。在47株陽性菌株中，對革蘭氏陽性細菌金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌具有抑菌作用的有27株，占陽性菌株的57.45%，占總菌株的23.89%；對所試驗的4種革蘭氏陰性細菌具有抑菌作用的有20株，占陽性菌株的42.55%，占總菌株的17.70%。

表2　菌株的抑菌活性篩選結果Tab.2 Antimicrobial activity of actinomycetes form Guangxi mangrove rhizosphere

3.5.2菌株酶活檢測結果

產酶實驗結果表明（表3），在所檢測的113株紅樹林根際土壤放線菌，有87株至少具有一種酶活，其中具有纖維素酶活性、淀粉酶活性、膠原蛋白酶活性、酯酶活性菌株分別為48.67%、54.87%、21.24%、 63.71%。另外，有70株具有至少2種以上酶活特性，占活性菌株的80.46%，占總菌株的61.95%；有46株具有3種以上酶活特性，占活性菌株的52.87%，占總菌株的40.71%；有8株具有4種酶活特性，占活性菌株的9.20%，占總菌株的7.08%。

表3　菌株的產酶活性篩選結果Tab.3 Enzyme activity of actinomycetes form Guangxi mangrove rhizosphere

4　討論

國內一些研究小組對廣西北部灣海域紅樹林共生和附生的放線菌開展過研究，如中國熱帶農業科學院生物技術所H ong等采集廣西26份紅樹林樣本，分離到了93株放線菌［12］。同樣是該研究小組2007年從廣西的紅樹林區采集了71個樣品，不進行微生物分離而直接發酵，取發酵上清液進行抗細菌、抗真菌與腫瘤細胞毒活性的測定，結果顯示：29.6%的樣品具有生物活性，僅次于取自?？诘臉悠罚?4.1%），在所有來自全國各地的樣品中僅在廣西北海古城嶺的樣品中檢測到腫瘤細胞細胞毒活性［13］。中國醫學科學院醫藥生物技術研究所魏玉珍等從廣西山口國家紅樹林生態自然保護區采集8種真紅樹植物和5種半紅樹植物，采用8種分離培養基，分離到118株放線菌。對77株陽性菌株分類表明44株屬于鏈霉菌屬，25株為小單孢屬的菌株，3株屬于糖絲菌屬，3株為諾卡氏屬菌株，1株是擬諾卡氏屬菌株，1株是倫茨氏菌屬的菌株［14］。廣西大學梁靜娟等和桂林醫學院駱耐香等也對紅樹林放線菌開展了部分研究［15—16］。這些研究結果表明廣西紅樹植物環境孕育了豐富多樣的放線菌，但從分離方法上看，并沒有全面系統地反映廣西北部灣海域海洋放線菌即便是紅樹林共生和附生的放線菌真實面目。

傳統分離培養法為了盡量殺滅細菌和真菌、使土壤放線菌孢子盡量分散，大多采用強化學試劑、強物理震蕩或高溫干熱處理，如超聲波處理法［17］、干熱處理法［18］、D DC法［19］和微波處理法［20］等，尚無采用原位培養法［21］進行放線菌分離培養的報道。傳統分離培養紅樹林土壤放線菌的方法大多比較激烈，并且使土壤放線菌離開它們原本生活的環境，放線菌的環境生長因子、營養成分勢必也隨之改變，可能對部分對環境要求苛刻的放線菌造成巨大傷害，從而不能分離培養這部分放線菌。而原位培養法能盡量在不改變微生物的生長環境和條件的情況下，將原位培養裝置置于紅樹林根際土壤中，讓放線菌菌絲生長進入原位培養裝置中，從而將放線菌俘獲。在實驗室進一步用多種不同的培養基將俘獲的放線菌分離、多次純化從而得到純培養的放線菌。原位培養法是在放線菌生長的大環境中與放線菌共培養，溫和而不刺激，為分離新放線菌提供了可能。

本實驗室設計的原位培養裝置是在Lewis等［8］的設計的基礎上進行改進的，Lewis K設計的原位培養裝置是為了在實驗室將原位培養裝置置于土壤樣品表面，俘獲透過下濾膜進入原位培養裝置的土壤放線菌。為了隔絕空氣中的菌體透過濾膜進入到原位培養裝置中上濾膜選擇0.03μm孔徑，選擇孔徑為0.2μm的下濾膜緊貼土壤表面，土壤中的放線菌菌絲可以透過下濾膜進入到原位培養基中生長。為了俘獲土壤中的放線菌，我們設計了可以在真實環境埋入泥土中俘獲土壤放線菌的原位培養裝置：上下濾膜都選用孔徑0.22μm的濾膜。這樣原位培養裝置上面及下面的放線菌菌絲都能進入原位培養裝置中，從而被俘獲。本研究成功俘獲分離113株放線菌，選取33株典型的放線菌提取其基因組D N A，擴增其16S rR N A基因，克隆后成功測序。33株放線菌中的32株隸屬于3個不同菌屬，其中鏈霉菌屬最多，占62.5%；擬諾卡氏菌屬占34.375%；倫茲氏菌屬占3.125%。得到一株G X U N10很可能隸屬于放線菌一個新分類單元。這表明原位培養裝置埋于紅樹林根際土壤放線菌原本生活的環境俘獲放線菌的可行性，為國內放線菌研究者尋找新的放線菌資源提供了新的參考途徑。并且我們用原位培養法所分離到的放線菌具有較好的抑菌活性和酶活活性，為后續放線菌次生代謝產物的進一步研究奠定了良好的基礎。

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In situisolation of actinomycetes and screening bioactive potential from mangrove rhizosphere soilsin Guangxi

Jiang Mingguo1，2，Gan Guanghua1，2，Yang Lifang3，Li Xini2，Yang Guil iu2，Tuo Li4，Sun Chenghang4，H uang Ling3，Lan Jinzhi3
（1.Guangxi Key Lab ofM angrove Conservation and Utilization，Guangxi M angrove Research Center，Eeihai536000，China；2.School of M arine Sciences and Eiotechnology，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Utilization of Microbial and Eotanical Resources，Guangxi University for N ationalities，Guangxi N anning530008，China；3.Schoolof Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University for N ationalities Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Eorest Products，N anning530008，China；4.Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Institute of Medicinal Eiotechnology，Eeijing100050，China）

In orderto efficiently capture actinomycetesfrom mangrove rhizosphere soi lsin Guangxi，trapsfor particularly cultivating actinomycetesin situwereimplanted into soi l and wereincubated for thirty days.A general selec-tive isolation procedure was employed onto fifteen different media.Phylogenetic neighbour-joining tree was conducted on the 16S rR N A gene sequences ofthe isolates and type strains.The biological activities and enzyme production of the isolated strains were evaluated.One hundred thirty-three actinomycetes were recovered.Of the thirtythree randomly picked isolates，twenty wereStreptomyces，eleven wereNocardiopsisand one wasActinosynnema. One isolate，G X U N10，was most closely related toNocardiopsiswith a low 16S rR N A gene sequence identity of 90.0%，and mightrepresent a new genus.Seven，four，eighteen，six，ten and threeisolates showed antimicrobialactivities respectively toEscherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Staphylococcus aureus，Proteusbacillus vulgaris，HemolyticstreptococcusandPneumococcus.Eifty-five，sixty-two，twenty-two and seventy-two isolates respectively showed cellulase，amylase，collagen enzyme and esterase activities.This study provides further evidence that unusual and rare actinomycetes from mangrove rhizosphere soi lsin Guangxican be recovered byinsitucultivation traps.

in situcultivation；mangrove；rhizosphere soils；actinomycetes；biological activity

Q938

A

0253-4193（2015）02-0055-10

2014-01-12；

2014-05-02。

廣西紅樹林保護重點實驗室（G K L M C-201204）；國家自然基金（31260004，81172963）；廣西自然基金（2012G X NSE A A053038）；高等學校博士學科點專項科研基金博導類項目（20111106110032）；廣西民族大學重點科研項目（2012 M DZD041）。

姜明國（1973—），男，吉林省長春市人，主要從事微生物資源研究。E-mai l：mzxyj iang@163.com

楊立芳。E-mai l：yanglf1990@163.com